CRISPR-Cas介导的酿酒酵母多重基因组编辑（上）

酿酒酵母是研究较为广泛的单细胞真核生物，它是一用于生产生物基化学品的重要工业微生物。除了传统的酒精发酵、烘烤过程和生物乙醇生产，酿酒酵母也被用于生产许多工业相关的化学品和蛋白质的异源表达。复杂代谢途径的工程应用如青蒿素前体合成和染色体从头合成已经证明了酿酒酵母可作为合成生物学领域的一强大的宿主。

在酿酒酵母表达或优化产物代谢途径，需借助于强有力的遗传操作工具，包括多基因敲除和基因多拷贝整合。细菌免疫系统CRISPR-Cas系统的出现，crRNA:tracrRNA复合物引导核酸酶内切酶Cas蛋白识别和切割含有PAM序列的靶标DNA，已被广泛用于真核和原核生物中进行基因编辑。小编在此针对酿酒酵母中CRISPR系统介导的基因敲除进行小结。

2013年，George M.Church实验室的DiCarlo等人首次利用酿脓链球菌来源的Cas9在酿酒酵母中的单基因敲除，为开启酵母中的多基因编辑做了重要铺垫。2014年，来自伊利诺伊大学赵惠民课题组的Bao等人建立的Hi-CRISPR系统能在酿酒酵母中以最高100%的效率同时敲除三基因1。Hi-CRISPR系统中的核心质粒为pCRCT，该质粒上囊括了酿脓链球菌突变Cas9(iCas9)、crRNA矩阵（研究人员巧妙的将供体DNA融合于间隔序列中）和tracrRNA。同年，Ryan等人在二倍体细胞中建立了Multiplex CRISPR(CRISPRm)系统，使用tRNA序列作为RNA聚合酶III的启动子，并采用5’HDV核酶丰富了sgRNAs的表达，以较高的效率在二倍体细胞中实现了三基因的敲除2。2015年，Jay D.Keasling实验室的Jakociunas等人将DiCarlo所建立的单基因敲除系统进行了升级，他们使用USER克隆构建方法在原来单sgRNA质粒基础上又叠加了另外四个sgRNA表达框，实现了最高100%的同时五基因敲除3。随后，Mans等人对构建含双sgRNAs表达框质粒的工作流进行了标准化，他们共转三个双sgRNAs质粒（即共锚定6个位点）实现了同时6基因敲除4。小编对酿酒酵母中这类用CRISPR系统辅助的多基因编辑方法做了相应的比较（表1），Hi-CRISPR虽是一单质粒系统，转化操作简单，但该方法中基因切割效率受crRNA排列数量/位置影响，当crRNA排列超过四个时，第四位的crRNA锚定的DNA切割效率急剧下降；CRISPRm需要额外增加5’HDV核酶；Jakociunas的多基因敲除虽不受sgRNA排列位置影响，但该方法需借助USER克隆，USER克隆试剂盒成本较高；Mans建立的方法虽能同时敲除6基因，但多质粒共同转化会大大影响效率。

以上CRISPR-Cas系统辅助的多基因敲除方法将在一定程度上加快对酵母底盘细胞的研究，尤其是对工业酿酒酵母的开发和探索。

Table1. Comparison of different methods for multiple gene disruption using CRISPR-Cas9

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