作物分子标记辅助选择的研究进展、影响因素及其发展策…

选择是育种中最重要环节之一，传统育种方法是通过表现型间接对基因型进行选择，这种选择方法存在周期长、效率低等许多缺点。最有效的选择方法应是直接依据个体基因型进行选择，分子标记的出现为这种直接选择提供了可能。借助分子标记达到对目标性状基因型选择的方法称为分子标记辅助选择 (molecular-assisted selection，MAS)，包括对目标基因跟踪即前景选择 (foreground selection)或正向选择，和对遗传背景选择 (background selection)，也称负向选择。背景选择可加快遗传背景恢复速度，缩短育种年限和减轻连锁累赘的作用。

1 分子标记辅助选择 (MAS) 的主要进展

近年来基因组研究的迅速发展为许多农作物提供了大量分子标记技术和多种多样的检测手段，使得 MAS 应用于作物遗传改良已成为现实，并已取得了长足进展，主要集中体现在以下几个方面。

1.1 基因聚合 (gene pyramiding)

作物的有些农艺性状(抗病等)表达呈基因累加作用，即集中到某一品种中同效基因越多则性状表达越充分。基因聚合 (gene pyramiding) 就是将分散在不同品种中的优良性状基因通过杂交、回交、复合杂交等手段聚合到同一个品种中。在这一过程中，一般只考虑目标基因(前景)选择而不进行背景选择。

最成功的例子是抗病基因聚合。在水稻抗白叶枯病上，Huang 等(1997)运用 MAS 技术分别将2～4个白叶枯病抗性基因 Xa4，xa5、xa13 和 Xa21 聚合到同一水稻 (Oryza sativa) 品种中。在水稻抗稻瘟病上，Hittalmani 等(2000)选用3个含单抗性基因的近等基因系分别两两杂交，从 F2 代选到含有两个抗性基因的植株，然后将各含两个抗病基因的单株继续聚合杂交，从 F2 代选到了同时含有 Pil/Piz-5/Pita 的改良单株。在小麦抗性基因聚合上，王心宇 等(2001)利用与白粉病抗性基因 Pm2、Pm4a、Pm8 和 Pm21 紧密连锁的 RFLP (restriction fragment length polymorphism) 和 SCAR (sequence characterized amplified region) 标记进行 MAS，选到分别聚合两个抗性基因的植株。

此外，柳李旺 等(2003)将棉花 (Gossypium hirsutum) 胞质雄性不育恢复系 0-613-2R 与转 Bt 基因抗虫棉 R019 (轮回亲本)杂交、回交产生 BC2 群体。利用 CMS 恢复基因 Rf1 紧密连锁的3个 SSR (single soquence repeats) 标记和 Bt 基因特异的 STS (sequence tagged site) 标记进行 MAS，培育出聚合有 Rf1 和 Bt 基因抗虫棉恢复系。

1.2 基因转移 (gene transfer)

基因转移 (gene transfer) 或称基因渗入 (gene transgression) 是指将供体亲本中有用基因(即目标基因)转移或渗入到受体亲本遗传背景中，从而达到改良受体亲本个别性状的目的。育种过程中将分子标记技术与回交育种相结合，可以快速地将与分子标记连锁的基因转移到另一个品种中，在这一过程中可同时进行前景和背景选择。

Chen 等(2000)以 IRBB21 为供体材料，对生产上广泛使用的‘明恢63’进行 MAS 改良，找到4个与 Xa21 紧密连锁的 PCR 标记。其中 RGl03、248 与 Xa21 共分离，C189、AB9 分别在 Xa21 两侧0.8 cM 和3.0 cM 处，并且选用了标记间最大图距不超过30 cM 均匀分布于每条染色体的128个 RFLP 标记用于背景选择。通过两代正向选择和负向选择，将导入片段限定在3.8 cM 以内。在 BC3F1 代的250个抗性单株中，运用 RFLP 标记选择到2株除目标区域外遗传背景完全恢复为‘明恢63’的个体，自交一代后运用标记248选出基因型纯合的抗病单株，从而得到改良的‘明恢63’。彭应财 等(2003)和童海军 等(2003)选育出抗病 (Xa21) 审定组合协优218和Ⅱ优8220。王春明 等(2003)利用抗叶蝉基因 Grh2 的 CAPS (cleaved auplified plfmorphism sequence) 标记，选出聚合抗叶蝉基因的水稻重要中间材料。Liu 等(2003)应用 MAS 技术将抗稻瘟病基因 Pil 回交转到‘珍汕97’中，得到背景恢复达97.01％的抗病材料。王新望 等(2000)利用3个SCAR 标记对 5Bphlb 。单体进行 MAS，仅3个世代就获得了3个冬小麦 (Triticum aestivum) phlb 中间育种系，大大缩短小麦育种年限，加快了育种进程。夏军红 等(2002)通过 MAS 与传统选育相结合的手段，将玉米 (Zay mays) S 组 CMS 恢复主效基因 Rf3 进行有效转移，选出新型的恢复系 MO17 (Rf3) 和 HZ85 (Rf3)。

1.3 数量性状的 MAS

作物大多数农艺性状(如产量、品质、抗逆性等)表现为数最性状遗传特点，表现型与基因型之间往往缺乏明显对应关系，表达不仅受生物体内部遗传背景较大影响，还受外界环境条件和发育阶段影响。对这些性状运用 MAS，育种者可以在不同发育阶段，不同环境直接根据个体基因型进行选择，既可以选择到单个主效 QTL (quantitative traitloci)，也可以选择到所有与性状有关的微效位点，从而避开了环境因素和基因间互作带来的影响。虽然数量性状的操作较质量性状困难得多，但近年来也取得了许多可喜成果。

Stuber (1995)通过 MAS 技术，在回交过程中同时进行前景选择和背景选择，把定位与产量有关的玉米 QTLs 分别从 Tx303 和 Oh43 转移到 B73 和 Mo17 两个自交系中，结果表明由这两个新改良自交系组配的杂交种，产量比对照杂交种增产15％以上。沈新莲 等(2001)用2个 RAPD (random anplified polymorphism DNA) 标记和1个 SSR 标记对一高强纤维主效 QTL 进行 MAS，提高了棉花纤维强度。研究者们利用 SSR 标记将产量相关的 QTL 从野生稻转入栽培稻 (Brondani et al.，2002；邓启云 等，2004)。此外在作物的品质、抗性等数量性状的改良上均有较好的应用 (Walker et al.，2002；Zhou et al.，2003；Dholakia et al.，2003；Zhou et al.，2003)。

2 影响分子标记辅助选择 (MAS) 的因素

大量理论和实践研究表明，影响 MAS 选择效率的因素非常复杂，其中标记与基因 (QTL) 之间的距离、目标性状的遗传率、群体大小和性质、选用分子标记数目以及标记与基因 (QTL) 的连锁相等是重要因子。

2.1标记与连锁基因 (QTL) 间的连锁程度

前景选择的准确性主要取决于标记与目标基因的连锁强度，标记与基因连锁得愈紧密，依据标记进行选择的可靠性就愈高。若只用一个标记对目标基因进行选择，则标记与目标基因连锁必须非常紧密，才能达到较高正确率。在理论上，在 F2 代通过标记基因型 MM 选择目标基因型 QQ 的正确概率 P 和标记与基因间重组率 r 有如下关系：P=(1-r)2，若要求选择 P 达到95％以上，则 r 不能超过2.5％，当 r 超过10％时，则 P 降至81％以下。如果用两侧相邻标记对目标基因进行跟踪选择，可大大提高选择正确率。在单交换间无干扰的情况下，在 F2 代通过标记基因型 M1M1 和 M2M2 选择目标基因型 QQ 的 P 值和 r 有如下关系：P=(1-r1)2(1-r2)2/[(1-r1)(1-r2)+r1r2]2，即使r1、r2 均达20％时，同时使用两个标记 P 值仍然有88.5％。潘海军 等(2003)在水稻 MAS (Xa23) 中，用单标记 RpdH5 和 RpdS1184 的准确率分别为9l.10％和87.13％，同时使用这两个标记 MAS 准确率则达99.0％，可见双标记选择效率比单标记高。

此外，重组值 r 也影响到由该标记位点等位基因分离产生遗传方差的大小r值越小，遗传方差越大，数量性状的选择效率越高 (Dudley，1993)。

2.2 性状的遗传率

性状的遗传率极大地影响 MAS 选择效率。遗传率较高的性状，根据表型就可较有把握地对其实施选择，此时分子标记提供信息量较少，MAS 效率随性状遗传率增加而显著降低。在群体大小有限的情况下，低遗传率的性状 MAS 相对效率较高，但存在一个最适大小，在此限之下 MAS 效率会降低，如在0.1～0.2时，MAS 效率会更高，但出现负面试验频率也高一些 (QTL 检测能力下降等)。因此利用 MAS 技术所选性状的遗传率应在中度(0.3～0.4)会更好 (Moreau et al.，1998；Berloo et al.，1999)。

2.3 群体大小和性质

群体大小是制约 MAS 选择效率的重要因素之一。一般情况下，MAS 群体大小不应小于200个。选择效率随着群体增加而加大，特别是在低世代，遗传率较低的情况下尤为明显 (Hospital et al.，1997a；Moreau el al.．1998)。所需群体数的大小随 QTL 数目的增加呈指数上升。计算机模拟表明：遗传率为0.1时，转移5个 QTL 较2个所需群体将增加8倍 (Zhou et al.，2003)。

群体连锁不平衡性越大，MAS 效率就越高。由两个自交系杂交产生的 F2 群体，其连锁不平衡性往往最大，因而其 MAS 效率也较高。

2.4 选用分子标记数目和类型

理论上标记数越多，从中筛选出对目标性状有显著效应的标机会就越大，因而应有利于 MAS，事实上，MAS 效率随标记数增加先增后减。MAS 效率主要取决于对目标性状有显著效应的标记，因而选择时所用标记数并非越多越好。Gimelfarb 和 Lande (1994)的研究表明，利用6个标记时，MAS 效率明显高于3个标记，但用12个甚至更多时，MAS 效率在低世代时反而降低，在高世代时增幅很小。一条染色体上有多个标记时，存在一个最适标记密度，在此之上则相对效率降低。计算机模拟研究表明当每条染色体上标记数增加到6个以上时效率降低 (Moreau et al.，1998)，最优距离为20 cM (Hospital et al.，1997a)。

沈新莲 等(2001)用2个 RAPD 标记和1个 SSR 标记进行纤维强度 QTL 辅助选择，比较显性标记和共显性标记之间纯合基因型和杂合基因型之间选择差异后，认为共显性 SSR 标记(可有效地剔除杂合基因型)对以加性/隐性为主遗传的 QTL 进行 MAS 效果会更好。

2.5 显性标记的相位

对质量性状的选择，无论目标基因是否显隐性，均需选择到纯合植株，但显性标记无法鉴定纯合与否。Haley 等(1994)研究菜豆 (Phaseolus vulgaris) 普通花叶病毒 (BCMV) 隐性抗性基因 (bc-3) 两 RAPD 标记一个相引 (M1，1.9 cM )，另一个相斥连锁 (M2，7.1 cM )时，用 M1 选择到纯合抗病、杂合体、纯合感病比例分别是26.3％、72.5％、1.2％，而用 M2 分别是81.8％、18.2％、0，据此提出相斥相显性 RAPD 标记不论对显性还是隐性基因均可极大提高选择效率。由此可预见用相斥相的显性 SCAR 标记跟踪目标基因比相引相应更有效。

2.6 世代的影响

在早代 (BC1)变异方差大，重组个体多，中选机率大，因此背景选择时间应在育种早期世代进行，随着世代的增加，背景选择效率会逐渐下降 (Chen et al.，2000)。在早期世代，分子标记与 QTL 的连锁非平衡性较大，随着世代的增加，效应较大的 QTL 被固定下来，MAS 效率随之降低 (Hospital et al.，1997a；Luo，1998)。

2.7 控制性状基因 (QTL) 数目

模拟研究发现随着 QTL 增加，MAS 效率降低。当目标性状由少数几个基因(1～3)控制时，用标记选择对发掘遗传潜力非常有效，然而当目标性状由多个基因控制时，由于需要选择世代较多，加剧了标记与 QTL 位点重组，降低了标记选择效果，在少数 QTL 可解释大部分变异的情况下，MAS 效率更高(吴为人 等，2002)。

2.8 控制数量性状 QTL 的划分、定位及其效应分布

QTL 的准确发现和对其效应无偏估计 (unbiased estimates of QTL effects) 有助于 MAS 效率提高 (Willcox et al.，2002)。QTL 精确定位取决于分子连锁图谱的饱和度以及对 QTL 性状的准确度量，可利用永久分离群体通过反复试验精确定位 QTL。Bohn 等(2001)提出用 CV (cross validation) 和 IV (validation with an independent sample) 分析方法对 QTL 效应和标记 OTL 遗传方差进行无偏估计。

互作大小直接影响着 MAS 效率。在特定条件获得的 QTL 分子标记连锁关系在不同年份间表现会不一致，在不同环境下进行表型鉴定也可能会造成 QTL 不一致。—般在不同年份间不同时期不同地点均能检测到的 QTL 的效果较好。

基因型对 QTL 检测有较大影响，杂交早代植株基因型是杂合的．随着自交代数增加，许多位点趋于纯合，在早代选择的植株到高代表现会与原先表现不一致，应重新估价和筛选分子标记 (Hospital et al.，1997a)。同一性状在不同群体间甚至不同群体大小间的 QTL 不一致，这些因素均影响 QTLs 检测并影响 MAS 的效率 (Moreau et al.，1998)。实践中，沈新莲 等(2001)在棉花纤维强度 MAS 改良过程中，QTL 在不同遗传背景、不同分离世代中稳定遗传，效应稳定，取得了理想结果。

低遗传率(0.3)时，QTLs 效应分布呈几何分布较呈均等效率高，但庄高遗传率时二者间差异不大 (Berloo et al.，1998；吴为人 等，2002)。

2.9 选择强度和 QTLs 的遗传方式和相位

在高选择强度下，常规选择更易丢失有利基因，MAS 效率随着选择强度升高而增加 (Berloo et al.，1998)。显性作用随着世代增加而降低，因此显性遗传 QTLs 的 MAS 效率高。当对多个 QTL 进行选择时，相引连锁比相斥连锁 MAS 效率高(吴为人 等，2002)。此外，Chen 等(2000)发现用标记进行消除连锁累赘时，两代单交换选择效率比一代双交换高，成本小。在低遗传率(＜0.3)，一类错误(假阳性)提高对 MAS 效率反而有利 (Hospital et al.，1997a)。在中等或较低选择强度下，目标基因 (QTL) 周围染色体区段由较远端标记控制更有效 (Hospital et al.，1992)。

3 分子标记辅助选择 (MAS) 的发展策略

在表型选择有效的情况下，MAS 更适用于隐性，限性，测定困难或费用昂贵以及未成熟期鉴定性状。在实际运用过程中应用一定策略，降低应用成本，MAS 的作用将可得到更大发挥。

3.1 定位作图与育种同步进行

育种群体与定位群体之间的重组频率是有变化的，不一定相同，在不同群体中 QTL 检测一致性低，而在同一群体不同世代中较高 (Bohn et al.，2001)。研究者对目标基因进行定位是为了利用这些基因，一个重要途径就是进行 MAS 提高种育种效率，为大规模培育优良品系或品种创造条件，而 MAS 希望使用在育种群体中与目的基因重组率仍旧较低的标记。方宣钧 等(2001)建议选择杂交亲本时尽量使用与育种直接有关的材料，所构建群体应尽可能做到既是遗传研究群体，又是育种群体，这样定位与 MAS 同步进行可缩短基因 (QTL) 定位研究与育种应用的距离，提高育种效率和 MAS 效益。

3.2 选择合适标记类型

适合于 MAS 的分子标记必须符合如下几个条件：检测手段简单快捷，易于实现自动化；DNA 质量要求不高，用量少，可以同时分析大量样品；信息量大，分析效率高；多态性好，在基因组中大量存在而且分布均匀；开发成本和使用成本低。目前已经发展出十几种标记技术，比较常用有 RFLP、RAPD、SSR、AFLP (amplified fragment length polymorphism)、SCAR、STS 和 CAPS 等。

理想分子标记应该是建立在 PCR 技术基础上，重复性高，在广泛基因背景下都能表达，在不同研究者中能相互交换使用，并能有效跟踪目标基因的标记，如水稻抗白叶枯病基因 Xa21 标记 pTA248。而选用何种分子标记来进行 MAS 选择，直接关系到选择效果。对于前景(目标基因)选择，所有标记技术都可以采用，但 PCR 标记最佳，共显性 SSR、CAPS 和 STS 是首选标记，其次是 SCAR。至于背景选择，应根据情况灵活选用，目前在低世代最合适的是 RAPD、AFLP 和 SSR 等，但在高世代 AFLP 由于可检测到更多多态位点而优于其他标记。

夏军红 等(2000)比较 AFLP 和 SSR 两种标记背景选择的相关性，发现达显著水平，结果具有同一性。因此，在实际应用过程中，选用一种标记类型进行背景选择即可。

3.3 DNA 提取的简化

1)半粒种子提取供试 DNA。将谷物类种子切分成两部分，带胚一半用于发芽播种，另一半胚乳用含蛋白酶 K 提取反应液，50℃～55 ℃ 温浴1小时，快速离心，100 ℃ 处理5分钟，离心后的上清液含有 DNA，可用作 PCR 分析。每次提取的 DNA 可进行25～50次 STS 反应和250～1000次 RAPD 反应。与叶片 DNA 结果一致，这种方法可进行早代选择 (Chunwongse et al.，1993；翟文学 等，1996)。2)碱法抽提 DNA。王春明 等(2003)从播种1～2周后水稻幼苗上取1～3 cm 长叶片放入备有适量0.4 mol?L-1 NaOH 的离心管中，用塑料棒碾磨至液体呈绿色，加160 μL Tris (100 mmol?L-1，PH7.5) 充分混匀，以稀释60倍后的上清液(浓度约5 ng?mL-1)作为模板 DNA (可置20 ℃ 保存)，取2 mL 至 PCR 板中进行 CAPS 分析(反应体系为20 mL)。原有的 DNA 大量提取法1个人平均1天能提取6～8个样品，而这些简便、快速 DNA 提取方法材料用量小，程序简单，化学试剂数量及用量少，DNA 质量高、数量多，每天均可以提取200个样品，完全可满足 MAS 育种需要。更简单的方法是利用成熟花粉粒制成悬液(经旋涡振荡和高温物理作用)后，可作为一种快速、简便、廉价的基因组 DNA 模板液直接用于 PCR 扩增(朱苏文 等，2002)。

3.4 快速 PCR 检测手段和体系优化

建立快速的 PCR 检测技术，检测显性 SCAR 标记时，可将琼脂糖凝胶电泳检测步骤省去，直接在 PCR 反应管中加入 EB 染色，在紫外灯下观测扩增产物的有无或者测定 PCR 产物浓度，鉴定是否有大量 DNA 存在，从而确定样品中是否含有目标基因(王新望 等，2000)。改造染色系统，利用甲烯蓝染琼脂糖凝胶，可直接在可见光下检测产物的有无。

减少 PCR 反应体积，可从20 μL 减少到15甚至10 mL，可大大地降低费用。当同时筛选到2个或以上的分子标记与目标性状连锁时，扩增产物具有不同长度但引物复性温度相匹配则可以在同一 PCR 条件下同时反应，这种多重 PCR 法的应用可显著地降低选择成本和筛选时间(王孝宣 等，2003)。

3.5 背景选择逐步选择法

段红梅 等(2003)对大豆 MAS 效果分析表明，用20条 SSR 引物与全部51条引物选出各株系的遗传背景回复率数值不同，排序也有差别，但是选择到相同株系比例较高。同时比较不同引物数目(10，20，30，40)与全部51条引物遗传背景回复率的相关性，相关系数分别为0.7520、0.8651、0.9344和0.9726，随着引物增加，相关程度也在增加，用40条引物几乎可得到51条的相同选择效果。夏军红 等(2000)对玉米染色体遗传背景回复率与基因组回复率的偏相关分析研究表明，绝大多数染色体与基因组遗传背景回复率的偏相关达显著水平，据此认为对有限数目染色体(一条或多条)进行背景选择可以达到对整个基因组选择类似结果。因此在背景选择中，当初始群体较大时，可以根据少数引物淘汰部分不符合选择要求的材料，再对遗传背景回复率较高的剩余材料增加标记进行进一步精确分析，在下一个世代对已恢复为轮回亲本的位点可不再选择。采用这种逐步选择方式，最终仍可选到最佳株系，这样可大大减少工作量，提高选择效率。

3.6 确定适宜的标记数量

使用3个分子标记的 MAS (Xa23) 符合率并不比使用2个有显著提高(潘海军 等，2003)，在实际应用中，选择2个位于基因两侧最近分子标记，这样不仅可以提高准确率，而且可以增加中选个体与受体亲本遗传背景同质性。Hospital 等(1997a)认为对每一个 QTL 最好用3个相邻的连锁标记进行跟踪选择，其中一个靠近目标 QTL，另两个近乎对称处在两侧。每条染色体(200 cM )或每一连锁群上2～4个标记用于背景选择，可得到理想选择结果(段红梅 等，2003)。选用标记时，首先应筛选出效应显著标记，当标记达到限度后，用低密度标记可降低成本减轻工作量，而不影响效率 (Moreau et al.，1998)。

3.7 数量性状标记辅助选择的方法

根据选择依据不同，数量性状标记辅助选择方法可分为基因型选择和基因型值选择阿种。吴为人 等(2002)用计算机模拟方法，对两种选择方法的潜力进行了比较，结果显示，两种方法的基本规律相似，除了在 QTL 数目很多又效应相等的情况下基因型选择表现较优之外，在其他情况下，两种方法的效果差不多。相对来说，基因型选择方法可以避免非加性效应和环境效应影响，因此具有优越性,但从应用角度看，基因型选择与基因型值选择相结合应是今后的发展方向。

3.8 确定合适选择方案

对于一些虽受主效基因控制，但可能还受—些背景基因影响的性状，只要供体亲本本身综合性状优良，就没有必要多次回交。可根据育种目标不同而进行1～2次回交或不回交，既可节约成本，提高育种成效，又可防止导入的基因丢失(罗彦长 等，2003)。在群体不够大，QTL 定位水够准确，每次至多导入4个 QTL，并且分步骤聚集 QTL 的回交育种方案比同时导入若干 QTL 更有效 (Hospital et al.，1997b)。用无重复的多点田间试验比一点重复试验易控制基因型与环境的互作并获得较大的遗传方差，并且可以检测出有利和不利 QTLs，提高 MAS 的效率，降低成本 (Ho et al.，2002)。

Ribaut 和 Betran (1999)提出 QTL 辅助选择的 SLS (single large scale) MAS 方法，即要求 QTLs 最好不超过3个，而且这些 QTLs 在不同的遗传背景及环境表达下稳定，占的表型变异为最大。Ho 等(2002)提出了 AB-QTL (advanced backcross QTL) 的选择方案，该方案可以打破 QTLs 间上位性作用，微效的加性和显性 QTLs 易检测出来，该方法将 QTL 的鉴定延迟了2～3代才进行，但可以大大缩短从 QTL 发现到品种培育的时间、从 QTL 的发现到测试 QTL-NIL 系仅需1～2年。Xie 和 Hu (1998)提出多性状同时 MAS 改良方法能聚集数量性状育种值，它的育种效果比常规方法选择或单个性状改良更好。因此找们可以根据育种的需要来确定合适的选择方案。

4 展望

尽管分子标记辅助选择 (MAS) 的背景选择效率很高，但在育种实践中，应将育种家的丰富选择经验和标记辅助选择相结合，依据个体表型进行背景选择的传统方法仍不应抛弃。而 MAS 普及的限制因素是成本与效益，因此应降低 MAS 的分析成本，提高分析鉴定技术，建立简单规范的操作体系。可以相信，随着分子生物学研究的新成果及其发展的新技术不断出现以及基因组学、生物信息学等研究的深入，和生物技术工作者与育种家围绕育种目标的真正结合，MAS 将会为作物育种作出更大贡献，使作物育种工作发生革命性变化。

注：
（1）文章来源：植物学通报，2005年 第22卷 增刊；
（2）作者单位：华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 等。