农药登记新知识：“化学指纹图谱”在植物源农药中的应用

作者：陈小军，王平，孟志远，等.

农业部2569号公告，在植物源农药母药（原药）登记要求中对植物源农药实施分类管理，根据所使用的植物有没有被长期广泛使用分为第1类植物源农药母药和第2类植物源农药母药。

第1类植物源农药母药：所用植物被广泛使用。此时应当提交该母药的组分分析报告，报告内容至少包括有效成分或标志性有效成分、相关杂质、溶剂的定性定量分析数据和5批次产品的“化学指纹”图谱。

第2类植物源农药母药：所用植物没有被广泛使用。应提交该母药完整的组分分析报告，报告内容至少包括有效成分或标志性有效成分、相关杂质、峰面积≥主峰面积10%的成分以及含量≥1%的成分、溶剂的定性定量分析数据和5批次产品的“化学指纹”图谱，定量分析所得的各种组分含量总和不得低于80%。

植物源制剂产品的登记中产品中有效成分或标志性有效成分的鉴别方法要求：（1）使用原药加工制剂的，至少应用一种试验方法对有效成分进行鉴别。采用化学法鉴别时，至少应提供2种鉴别试验方法；（2）使用母药加工制剂的，应采用制剂的“化学指纹”图谱中的特征峰和保留时间对产品进行鉴别。

现代“指纹”鉴定始于19世纪末20世纪初的犯罪学和法医学。由于基因学发展，近代将指纹分析概念与生物技术结合延伸至DNA指纹图谱分析，应用范围从犯罪学扩大至医学和生命科学领域。指纹图谱技术应用于天然产物质量控制可追溯至20世纪70年代初；广义的指纹图谱包括化学指纹图谱和DNA指纹图谱，狭义图谱仅指化学指纹图谱。指纹图谱技术在中药或天然药物质量的控制中的应用相比在农药方面的应用要更加的丰富。

在构建指纹图谱的方法上，近年来国内外学者研究中药指纹图谱的方法主要包括TLC(薄层色谱)、HPLC(高效液相色谱)、GC(气相色谱)、HPSCCC(高速逆流色谱)、HPCE(高效毛细管电泳)、IR(红外光谱)、NMR(核磁共振波谱)、X -Ray(X -射线)以及LC-MS/MS(液相色谱-串联质谱)和GC-MS(气相色谱-质谱联用)等，其中色谱学方法是构建指纹图谱的主流方法，尤其是TLC、HPLC和GC色谱技术，已经成为大家公认的3种常规分析手段。

众所周知，传统有机合成农药的长期使用带来的种种弊端如有害生物抗药性的产生、残留毒性及环境污染等已成为危及人类健康、食品安全、生态平衡和社会发展的一个危险因素。开发高效低毒的有害生物控制剂的呼声日益高涨，其中植物源农药的研究和开发是解决当前化学农药诸多负面效应的一个重要研究方向。化学农药的活性成分较为单一，目标明确，易于检测分析，也易于标明有效成分的含量和名称，与化学农药不一样，植物源农药成分较为复杂，并且很多成分均具有生物活性，只是在含量和活性高低上有所差异，很难标明植物源农药所有活性成分的名称和含量。在农药登记过程中，要求标明化学农药中活性成分的含量和名称，甚至要求明确杂质的含量和名称，在毒性测定中，要求对原药和杂质均进行毒性测定，但对植物源农药来说，这些要求很难达到，如苦参碱杀虫剂中可能含有50多种生物碱或其他杀虫成分，很难同时拿到50多种活性成分的标准品，也很难对50多种成分进行定量分析，即难以明确表明所有活性成分的含量和名称及各活性成分之间的比例。

我国植物源农药质量标准的制定过程中，主要是采用某种分析检测手段如HPLC或GC测定其中某一种主要有效成分，并以此含量高低来判断某种产品的质量。这种质量控制模式不能全面、综合地反映出植物源农药产品的质量变化，并由此产生了植物性农药市场的某些混乱局面，如产品良莠不齐，不同厂家生产的同一种制剂或同一厂家不同批次生产制剂的药效差异较大，制剂稳定性差。因此植物源农药的质量和稳定性问题已成为制约其发展的瓶颈。

植物源农药一般标明的是含量和活性均较高的最具代表性的活性成分，如0.3%印楝素乳油、2.5%鱼藤酮乳油、0.25%苦皮藤乳油和0.04%苦参碱水剂等，但是这种方法并没有完全正确标明植物源农药的本质。如0.3%印楝素乳油标明的活性成分是印楝素A，但仅印楝素B的含量在制剂中就可达到印楝素A的1/8~1/3，并且2者的活性没有本质的差异，印楝素A纯品与印楝种子甲醇提取物(印楝素A含量约1%)的活性也没有非常大的差异。在毒性测定过程中，也难以对50多种活性成分均进行毒性检测。同时也难以对植物源农药原药中的杂质进行分离鉴定和定量分析，难以单独进行毒性测定。如0.3%印楝素乳油和0.23%苦皮藤乳油的原药中近80%的成分可能是非活性成分，将杂质一一分离鉴定并得到标准品，并对杂质进行定量分析和毒性测定，将大大提高植物性源农药的登记成本。因此可以将指纹图谱技术引入到植物源的质量控制体系中来，通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别植物材料的真伪；通过指纹图谱主要特征峰的面积和比例的制定，能有效控制样品质量，保证样品质量的相对稳定。

但指纹图谱技术在植物源农药研究中很少报道，如左金梁等利用RP-HPLC法同时测定白屈菜药材中血根碱、小巢碱和白屈菜红碱等含量，也是指纹图谱在植物源农药中应用较早的报道；刘丽娜等利用高效液相色谱-电喷雾/四极杆-飞行时间串联质谱，通过与对照品保留时间、准确分子量及其一级、二级质谱比对，进行成分鉴定，测定苦木中苦参碱与氧化苦参碱的定量方法研究，研究发现苦木中含有微量的苦参碱及氧化苦参碱成分，不同产地不同部位的苦木药材中苦参碱与氧化苦参碱含量差别较大，所建立的方法专属、灵敏，可作为苦木中苦参碱及氧化苦参碱的识别依据。

鱼藤根是经典的杀虫植物，但鱼藤根批次间质量差异大，而且鱼藤根的质量与其原产地密不可分，缺乏鱼藤根及产品的质量标准和控制体系。 陈小军等对丰顺鱼藤根丙酮冷浸提取物进行HPLC检测分析，色谱分离效果良好，采用标准品对比的方法，确认色谱图上的部分化合物染料木素、鱼藤酮、反查尔酮、灰毛素、脱氢灰毛素。对丰顺鱼藤根的甲醇提取物中，采用HPLC对丰顺鱼藤根的丙酮冷浸物进行分离时，发现λ =254 nm时，HPLC色谱图中的峰的为37个，而在λ =240 nm情况下HPLC色谱图中的峰为34个(见图1~2)。

图1 丰顺鱼藤根丙酮冷浸物HPL色谱图（λ =240 nm）

图2 丰顺鱼藤根丙酮冷浸物HPL色谱图（λ =254 nm）

采用HPLC法对丰顺鱼藤根的丙酮冷浸提取物进行了10次的HPLC检测分析，研究表明所建立的丰顺鱼藤丙酮冷浸提取物在稳定性试验时保留时间和峰面积的相对标准偏差均小于1.5%；精密度试验时37个共有峰相对保留时间的相对标准偏差均小于1.0%，质量分数的相对标准偏差均小于2%；在重现性试验时各峰相对保留时间的相对标准偏差均小于1.5%，重现性较好。因此所建立的方法适合鱼藤根指纹图谱的构建工作，为指纹图谱的整个体系的构建提供了可靠基础。

对于农用活性植物而言，指纹图谱可以用来鉴别真伪，评判优劣；而对于植物源农药产品，它可以作为产品的质量标准，用以鉴别产品真伪，控制产品批间质量差异，评价工艺的合理性。农用活性植物中的化学成分为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，但现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法都不足以解决这一问题。

因此建立农用活性植物指纹图谱将能较为全面地反映植物中所含化学成分的种类与数量，进而对活性植物和植物源农药产品质量进行整体描述和评价，这也正好符合植物源农药中药化的发展趋势。具体做法可以对天然活性植物的主要成分进行提取分离，采用HPLC、LC-MS/MS、GC-MS等多种方法对活性植物的主要特征成分进行定性、定量分析，采用计算机谱图解析技术解析色谱图，获得指纹特征，建立不同品种和产地活性植物的高效指纹图谱；采用灰色关联度分析法和化学计量法，建立活性植物指纹图谱与活性之间的关系模型。 在此基础上，将活性植物的各指纹特征成分与其活性效果结合起来，建立“谱效学”研究，可使活性植物质量与其活性真正结合起来，有助于阐明活性植物的作用机理。因此活性植物指纹图谱的研究和建立，对于提高植物源农药产品质量、质量体系和产品质量标准的建立具有重要的指导和现实意义，并将有效地促进植物源农药产业的健康发展。

如今，随着农业部2569号公告的深入落实，相信农药企业或者农药研究者对于植物源农药“化学图谱”的认识与应用将会不断的深化，从登记的角度更应当加强在该层面的研究与交流学习，以期在未来助力于植物源农药在国内的进一步发展。