CRISPR女神创办公司放“大招”：CRISPR-Cas9全基因组剪切位点图谱

CRISPR的火热及其在临床上应用的美好愿景，令这一技术相关的公司不断涌现，除了张锋等人创办的Editas Medicine，Emmanuelle Charpentier等人的ERS Genomics，另外一位CRISPR先驱Jennifer Doudna也创办了自家公司：Caribou Biosciences，这家公司2015年与杜邦达成战略合作，推进两家公司基于CRISPR的基因组编辑技术平台的发展。

5月1日这两家公司合作完成的最新研究成果：Mapping the genomic landscape of CRISPR–Cas9 cleavage，公布在Nature Methods杂志上，提出了最新的检测技术，并为我们展现了CRISP-Cas9全基因组范围内的剪切位点。

来自CRISPR-Cas微生物免疫系统的RNA导向内切酶Cas9已经成为有力的基因组编辑工具，能用于多种生物中，进行基因和非编码遗传元件的编辑修饰。目前Cas9介导的基因组编辑技术已经被应用到了眼、耳、肝和肌肉相关疾病的治疗中，但是组织特异性传递不理想依然是一个问题，这主要是因为几方面的原因，如直接整合到基因组DNA上，由细菌Cas9蛋白在编辑细胞中的持续表达引起的免疫应答和脱靶编辑。

此前研究人员曾提出过一种解决办法，就是利用非遗传编码，预组装和短寿命的Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物，这种复合物由单个导向RNA（sgRNA）和Cas9（sgRNP）组成，通过与两个DNA区域（protospacer和PAM）序列特异性作用，从而识别DNA。Protospacer主要通过靶标DNA与一个位于sgRNA的5'末端，长为20-nucleotide的互补序列之间的碱基配对来完成反应，而PAM结合则是由C-末端PAM作用结构域中的Cas9氨基酸残基与靶标DNA之间的直接相互作用来促进。Cas9可以容忍由于protospacer和PAM识别错配，导致的脱靶核酸酶活性。

检测脱靶效应的实验方法

双链断裂（DSB）的细胞修复可能会导致诱变插入或缺失（indel），甚至出现较大的染色体重排。因此，科学家们希望能通过全基因组检测sgRNPs的脱靶剪切，尤其是目前CRISPR-Cas9已经被用于了多种各种生物技术应用。

近年来研发出了不少检测脱靶剪切酶活性的实验方法，比如2014年麻省总医院的GUIDE-seq（Genome-wide Unbiased Indentification of DSBs Evaluated by Sequencing），即利用一种短双链寡核苷酸来标记CRISPR-Cas诱导的脱靶断裂，测序这些标签所在的基因组区域，就能够确定脱靶突变的位置。此外其它还有几种基因组检测方法。

但是这些技术都存在局限性：利用合成突变文库的方法存在本身文库设计上的偏向性；全基因组技术如GUIDE-seq和HTGTS依赖于细胞事件（供体序列的整合或染色体易位）。这些方法会导致DNA修复中的位点和细胞系依赖性差异，以及编辑事件和细胞分裂之间相互作用的混淆。Digenome-seq可以通过测序基因组DNA，来检测Cas9切割位点，但这需要高读取深度。因此，Digenome-seq也会缺乏检测可能Cas9-sgRNA切割位点全部谱带的敏感性，而且它也不适用于筛选大量的导向RNA。

SITE-Seq新技术

为了解决这些问题，在这篇最新文章中，研究人员研发出了一种新生化方法，通过测序（SITE-Seq方法）选择性富集和识别标记基因组DNA末端，从而在纯化的基因组DNA中找到Cas9的切割位点。

( SITE-Seq 流程)

SITE-Seq是一种生物化学检测方法，因此基因组DNA可以通过一系列sgRNP浓度进行消化，从最低到最高，从而可以进行高分辨率和低切割灵敏度的脱靶位点鉴别，这样研究人员就可以细致全面的检查细胞中可能的脱靶位点，检测突变频率和功能性细胞影响。而且SITE-Seq也能创建高度富集sgRNP切割片段的测序文库，帮助以最小的读取深度进行特异性分析，这是将SITE-Seq作为高通量指导选择工具的一个至关重要的特征。

最终，研究人员利用SITE-Seq来描绘了一组sgRNP生化切割的图谱，检测了靶向人类基因组的sgRNA的Cas9特异性，这些位点的数目取决于sgRNA序列和核酸酶浓度，在较低浓度下鉴定的位点显示出细胞中脱靶突变的倾向性较高，脱靶位点列表也指出细胞内Cas9活性受到sgRNP递送，细胞类型和暴露于核酸酶的持续时间的影响。

这项研究证明SITE-Seq方法可以用于识别基因组DNA中的剪切位点序列，而我们在评估核酸酶活性和特异性时，可以将脱靶位点生化简单方法，与单独的细胞活性检测方法相结合，这样能得到更好的效果。

CRISPR各路公司

Caribou Biosciences与Editas Medicine、CRISPR Therapeutics是致力于CRISPR技术应用开发的三家主要公司之一。2013年11月25日，CRISPR先驱张锋依靠4300万美元的风投创办了 Editas Medicine，CRISPR女神 Jennifer Doudna也是联合创始人。张锋获得CRISPR专利之后，Jennifer Doudna与公司中断关系，并将自己的知识产权授权给了Intellia Therapeutics，同时创立了Caribou Biosciences。

Intellia Therapeutics

“开发潜在的治疗性基因编辑治疗，积极改变那些生活在生命边缘的患者生活”

Intellia Therapeutics成立与2014年，总部位于美国马萨诸塞州剑桥市，专注于利用生物工具CRISPR / Cas9系统开发专有的潜在治疗药物。作为Editas Medicine最强大的竞争对手，Intellia获得了CRISPR先驱之一的女科学家Jennifer Doudna授权的相关知识产权。

Caribou Biosciences

“将科学专业知识与诚信、质量体系相结合，提供满足或超越客户期望的有益安全产品”

位于美国加利福尼亚州的Caribou Biosciences是一家专注基因工程的生物技术公司，开发细胞工程和分析的尖端解决方案。公司的CRISPR-Cas9技术平台将CRISPR系统作为原核适应性免疫的一种形式，入侵噬菌体、质粒。当Cas9与引导RNA配对时，可以切割双链DNA，从而对DNA进行特异性的改变。这些位点特异性DNA修饰可用于进行复杂的基因敲除。

Caribou利用CRISPR-Cas基因编辑技术正在转化生物研究，开发新的生物基产品。公司的研究平台有能力在不同的细分市场生产变革性药物。2014年，Caribou共同创立了Intellia Therapeutics公司，这家新成立的公司利用Caribou的CRISPR-Cas9技术平台开发基因治疗药物。

Agenovir

Agenovir主要依靠斯坦福大学科研团队和联合创始人Stephen Quake的学术基础进行技术开发，该公司计划使用包括CRISPR/Cas9在内的计算工程核酸酶破坏胞内病毒DNA预防感染以及接触胞内病毒的逆转录。该公司隶属于强生JLabs @SSF生物技术孵化器。

前斯坦福大学博士后，清华大学王建斌以及香港科技大学的Angela Wu同时也是Agenovir的合伙人。

Editas Medicine

成立于2013年9月，总部位于美国马萨诸塞州坎布里奇市，是一家生物医药行业的明星公司，专注于开发精准基因编辑和治疗致命性遗传病的技术。5名创始人均出自美国名校，他们是张峰、Jennifer A. Doudna、George Church、J. Keith Joung和David R. Liu。值得指出的是，张峰和Jennifer A. Doudna是CRISPR技术的发明人，因为，Editas Medicine也当仁不让的成为基因编辑技术先驱。

2016年1月4日，Editas Medicine向美国证券交易委员会（SEC）提交了IPO申请，准备在纳斯达克上市，发行价16-18美元，股票代码为EDIT。2月3日，EDIT作为美国2016年的第一宗IPO正式登陆纳斯达克，从而成为基因编辑“第一股”。