分子剪刀改造微藻基因组 助推第三代生物燃料研发
生物探索,2012-06-27
导读：分子剪刀改造微藻基因组，第三代生物燃料有望研发出。Cellectis公司研发的分子剪刀能够修饰或更改目标基因，从而改变微藻性状。该公司已经将该技术商业化，并推广到生物生产、农业和医药行业的学术研究中。以微藻为对象，依托分子剪刀技术，第三代生物燃料有望研发出。 近日，法国大型生物技术公司Cellectis总裁安德烈•舒利卡先生(Andre Choulika)表示，从现在起到2013年1月公司将证明基因组改造能使用微藻来制造第三代生物燃料。目前Cellectis公司应主要证明其技术在藻类植物中的有效性。
Cellectis公司研发了能够干预脱氧核糖核酸(ADN)的分子剪刀，通过此分子剪刀，公司能够改变或更换疾病突变载体基因，并改变植物机体。该公司还负责实现分子剪刀的商业化。公司已经将该技术推广到生物生产、农业和医药行业的学术研究中。
基因组改造实验如果成功，从2013年1月起的未来四年内公司将在法国石油化工集团道达尔公司(Total)的协助下进行石油代用品的试验生产。该阶段的投资金额将达到数百万欧元。
根据双方签订的协议，Cellectis公司和道达尔公司将共同支付该项目所需的成本。目前，两家公司均没有透漏相关的财务信息。从2012年2月起十名研究人员就已经开始共同从事该项目的研究，此外，两家公司将分别持有相关技术和产品50%的份额。舒利卡先生表示，在最初几年内，该项目每年的开发成本将至少为数百万欧元。而在试点阶段，所需金额将达到数千万欧元。
基因组改造技术
普鲁兰酶基因克隆表达及枯草芽孢杆菌基因组的改造[1]
根据整合到基因组上的目的基因来源，分别构建了两种整合方式的载体，即单交换和双交换整合载体。对于枯草芽孢杆菌本身来源的巯基-二硫键氧化还原酶基因bdbC，bdbD，直接将其作为同源片断，由于bdbC，bdbD共用一个启动子，在基因组上以操纵子的形式存在，因此构建的单交换载体命名为pACC-BdbDC。对于大肠杆菌来源的巯基-二硫键氧化还原酶基因ds.C，dsbD，dsbE，dsbG，则需要在枯草芽孢杆菌基因组上选择整合位点，在其整合位点附近各选取500bp基因作为同源片断，克隆到pBSK-p1p4-Cm上，构建了基因敲除载体。再将dsbC，dsbD，dsbE，dsbG插入到该载体的两个同源片断之间，分别构建了双交换载体pDGC和pDsbE。
将以上构建好的单交换和双交换载体分别转化枯草芽孢杆菌B.su.168，结果巯基-二硫键氧化还原酶基因整合到枯草芽孢杆菌基因组上，成功改造了枯草芽孢杆菌遗传背景。
戊型肝炎病毒SAAS-JDY5株基因组全长cDNA的构建及其改造[2]
传统的以限制性内切酶和连接酶为基础的DNA重组技术曾经革命性地推动了分子生物学和遗传工程的发展，至今仍然发挥着重要作用。但是实验室原有的片段太多，找酶切位点比较困难。用overlap pcr连成4个长片段后就相对容易一些，利用4626位置上的KpnⅠ和载体上的XbaⅠ这两个酶切位点将中间两段连接，从而形成3个大片段（1～2474，2094～6645，5186～7232）。In-fusion法的原理跟基因同源重组类似，利用DNA片段的同源关系将目的片段定向地插入载体中。这个方法只需一个单一的酶切位点将载体线性化即可，不需要两个单一的酶切位点，条件没有前面苛刻，所以结合这个方法用于最后两步连接。先利用载体上的XbaⅠ酶切位点将前两段连接（1～5318），然后利用5245位置上的FseⅠ酶切位点将最后两段连成HEV的全长cDNA。In-fusion法需要重新设计引物，使目的基因的两端带有载体两端的同源序列。虽然也涉及到PCR过程，但是以质粒为模板，难度相对overlap PCR要小，可以扩增3kb左右大小的片段用于连接。
为了保证这个HEV的全长cDNA克隆具有感染性，又对它进行了修正。在测序之后发现5’端有94个碱基与原序列比对不上，另外在2467的位置多出了5个碱基，我们需要将这一段替换掉。为了保证序列的准确性，重新从病料中提取SAAS-JDY5株的RNA，进行反转录（RT-PCR）。设计套式特异性引物，并在5’端引入T7 RNA聚合酶启动子，进行巢式PCR（Nest-PCR）扩增出目的片段，用新的正确的片段替换掉原来错误的片段，获得正确的SAAS-JDY5株HEV的全长cDNA克隆。
基于基因组DNA诱变的遗传重组改造乙醇工业酵母的耐热性及发酵性能[3]
通过化学诱变和基于基因组DNA诱变的遗传重组技术对乙醇工业酵母菌的温度适应性进行改造，获得耐热性能和发酵性能得到提高的重组酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae T44-2。重组菌株T44-2的最高生长温度比原始菌株CE6提高了3℃，48℃和52℃热激处理1 h，重组菌株的细胞存活率分别是原始菌株的1.84和1.87倍。重组菌株在30℃～40℃范围内具有良好的糖醇转化率和乙醇产量，发酵200g/L葡萄 糖能够产生83.8～91.2 g/L乙醇。重组菌株在43℃和44℃发酵时乙醇产量仍分别有69.2 g/L和52.6g/L，而此时原始菌株基本没有活性。研究结果为酿酒酵母在乙醇高温发酵中的应用奠定了基础，可极大降低冷却成本。
生物燃料研究
生物燃料最新发展态势分析[4]
第一代生物燃料的生产工艺已经较为成熟，美国、欧盟和巴西等一些国家已经形成了较完善的产业链。以纤维素乙醇为代表的第二代生物燃料是更有希望的替代燃料，但目前还未获得关键性的技术突破，其大规模的商业化生产尚待时日。目前生物燃料正处于从第一代向第二代发展过渡的初期。各国纷纷将发展第二代生物燃料定为国策，为此制订了长期的发展规划与目标，并为生物燃料发展提供了良好的政策环境和大力的经费支持。各相关研究机构与企业也积极行动，力图解决生物燃料发展的各个关键问题。在此过程中，一些与生物燃料可持续发展有关的重要问题也引起了人们的关注。
利用藻类生物质制备生物燃料研究进展[5]
生物柴油和生物质油的可持续健康稳定发展，必须有稳定和优质的原料来源。藻类生物质即是生产生物燃料的优良原料。本论文介绍了微藻的概念，综述了利用微藻制备生物柴油和生物质油的国内外研究进展，尤其是制备微藻方面的生物基因工程、新反应器和联产技术，以及微藻直接热解制备生物质油和直接燃烧利用的技术。探讨了利用微藻制备生物燃料的优点和存在的问题。
Cellectis公司的举动
法国Cellectis公司获得日本Tobacco公司Pureintro技术授权
法国基因技术公司Cellectis公司的美国分公司Cellectis Plant Sciences（位于明尼苏达州圣保罗）获得了日本Tobacco公司授权，获准使用Tobacco公司的土壤杆菌介质转化植入技术 PureIntro，celletics公司将可以使用这个技术来研发转基因玉米和水稻产品。
Cellctis 公司在大范围核酸酶基因工程研究领域处于领先地位，它的许多研究成果被成功运用于多种作物上，能对基因序列进行插入，删除或者改性操作，使得植物能表达出 新的性状（比如抗旱，提高营养成分，抗病害等），美国分公司Cellectis plant sciences是于今年刚刚成立的，负责基因工程涉农领域的全面研究。
Cellectis推出源于人诱导多能干细胞（iPS）的肝细胞产品
法国生物公司Cellectis集团下的Cellectis干细胞部宣布推出来源于人诱导多能干细胞（iPS）的肝细胞产品，即hiPS-HEP。hiPS-HEP具同质性、再生性及生命周期长且CYP活性稳定的特点，能够为药物发现、毒性试验与疫苗研发等一系列体外研究提供理想的平台。
Cellectis干细胞部首席科学家（CSO）Johan Hyllner表示，各医药产业间的的高度相关性会使hiPS-HEP成为颇具前景的研发系统。“制药企业迫切需要应用于药物研制早期更佳的、与临床相关性更高的模型，以评价肝毒性、发现新的药物靶点及研发新疫苗，”Hyllner 补充道。hiPS-HEP来源于人诱导多能干细胞（iPS），严格依照质量控制和伦理批准程序。
[1] 胡海红.普鲁兰酶基因克隆表达及枯草芽孢杆菌基因组的改造. 生物化学与分子生物学. 2009
[2] 王茜.戊型肝炎病毒SAAS-JDY5株基因组全长cDNA的构建及其改造. 南京农业大学. 2010
[3] 刘秀颖，何秀萍，卢莹，张博润.基于基因组DNA诱变的遗传重组改造乙醇工业酵母的耐热性及发酵性能. 生物工程学报. 2011
[4] 邓勇,房俊民,陈方,陈云伟,王春明.生物燃料最新发展态势分析[J]. 中国生物工程杂志. 2008
[5] 嵇磊, 张利雄, 姚志龙, 闵恩泽.利用藻类生物质制备生物燃料研究进展[J].石油学报.2007
