小白杏自交不亲和基因S-RNase的克隆及正、反义表达载体的构建

本研究以新疆栽培杏品种小白杏(Prunus armeniaca L. cv.)为试验材料，利用特异引物(索柱full1/索柱full2)扩增S66-RNase(GenBank登陆中)。将S66-RNase(cDNA)插入到克隆载体pMD19-T后，获得pMD-S66-RNase，借助中间表达载体PBS-T，利用两次双酶切(HindIII/BamHI和KpnI/BamHI)连接，将克隆的S66-RNase基因片段(cDNA)正向插入到pCAMBIA中，构建S66-RNase基因正义表达载体pCAMBIA-Sense-S66-RNase；利用pMD-Antise-S66-RNase与pCAMBIA上一致的酶切位点(HindIII和BamHI)，通过酶切连接的方法，将克隆的S66-RNase基因片段(cDNA)反向重组到表达载体中，构建S66-RNase基因反义表达载体pCAMBIA-Antise-S66-RNase；用电击转化法将重组质粒转化至农杆菌LBA4404中。结果显示，通过RT-PCR获得739 bp的S66-RNase基因(cDNA)片段，其ORF长度为672bp(第44-714bp)。对两个表达载体进行酶切检验显示，S66-RNase基因(cDNA，739bp)正确地插入到pCAMBIA的CaMV35S启动子和NOS终止子之间，表明S66-RNase基因的正义、反义表达载体构建成功；经PCR限制性内切酶酶切和测序鉴定表明本研究也成功地将S66-RNase基因正义和反义两种表达载体转入农杆菌LBA4404中。在本研究中，克隆出了S66-RNase的ORF，获得了S66-RNase的正义和反义表达载体，为深入的研究果树S-RNase基因功能和自交不亲和机制的提供了帮助。