苏州大学973首席科学家CRISPR研究成果
2016年3月15日，苏州大学基础医学与生物科学学院王晗课题组，在国际著名学术期刊《Scientific Reports》发表一项最新研究成果，题为“Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp”。这项研究证明，TALEN和CRISPR-Cas9都是修改普通鲤鱼基因组的高度有效的工具，并为促进鲤鱼遗传学研究和育种，开辟了新的途径。
本文通讯作者为苏州大学基础医学与生物科学学院博士生导师、特聘教授王晗，其本科毕业于安徽大学，获中科院硕士学位，美国韦恩州立大学博士学位，曾在美国佐治亚医学院、俄勒冈大学和俄克拉荷马大学从事博士后研究和助理教授，2009年至今，任苏州大学医学部基础医学与生物科学学院特聘教授、国家重大研究计划项目首席科学家。主要研究方向为生物钟分子遗传和基因组调控机制、生物钟对生殖和发育的影响、生物钟进化的分子遗传和基因组机制等领域，曾在 Nature Genetics、Development、Evolution和Journal of Molecular Evolution等杂志发表40余篇学术论文。
在2014年12月份，王晗教授带领的课题组，利用TALEN技术，成功制备了两种斑马鱼per2无效突变体，阐明了Per2在斑马鱼生物钟中的基本功能，并为PER2在脊椎动物昼夜节律系统中的积极作用，提供了关键的证据，相关研究发表在《Journal of Biological Chemistry》杂志 (苏州大学利用TALEN技术研究斑马鱼生物钟)。此后，相继有研究机构在斑马鱼中进行了CRISPR研究，例如：快速便宜的CRISPR/Cas9突变体筛选方法；用CRISPR实现斑马鱼高效基因敲入；用CRISPR/斑马鱼实现大规模基因打靶。
普通鲤鱼(Cyprinus carpio)作为一种杂食的滤食性鱼，在100多个国家广泛养殖，其驯化品种锦鲤，因其鲜艳的花纹和图案，成为最受欢迎的户外观赏鱼。普通鲤鱼作为一种重要的水产养殖品种，通常体重超过3公斤，能够长到1米的长度。鲤鱼的年产量约为370万公吨，价值5.31亿美元。
鲤鱼也是生态学、进化、环境毒理学、生理学、营养学、免疫学、发育学、育种和转基因研究的一种模式生物。虽然鲤鱼作为一种食物来源具有重要的经济价值，但它的肌间骨，使其在世界一些地区并不是一种美味佳肴。因此，为了提高其品质和经济价值，并且方便其作为生物模型的实用性，迫切需要对其进行遗传改良。然而，由于其相对较长的成熟期——约3至4年，较不频繁的产卵——每年只有一次，使得鲤鱼的遗传学研究和育种一直都是非常困难的。
随着最近有关“普通鲤鱼基因组草图序列以及其他遗传和基因组资源”的报道出现（我国科学联合完成首个鲤鱼全基因组序列图谱），鲤鱼研究领域最迫切的需要是，对其开发基因组编辑工具。为此，该研究小组将TALEN和CRISPR技术应用于鲤鱼研究。TALEN和CRISPR-Cas9是两种设计的位点特异性基因组编辑系统，各自由一个DNA识别/结合部分和一个DNA裂解部分组成。
在TALEN系统中，两个TALE结构域是DNA识别/结合部分，两个FokI结构域是DNA断裂部分，而在CRISPR-Cas9系统中，单导向RNA（gRNA）负责DNA识别/结合，Cas9内切酶用来切割DNA。一对TALENs或者一个具有Cas9蛋白的gRNA，可以引起位点特异性的DNA双链断裂（DSBs），这会诱导内源性非同源末端连接（NHEJ）的DNA修复途径，以在人体细胞和许多物种（包括大鼠、小鼠、斑马鱼、牛和植物）以及许多领域（如基础研究、临床治疗、农业和畜牧业）的靶基因中产生插入缺失突变。
此外，CRISPR-Cas9具有操作容易、效率高和比TALEN成本低的优势，尤其是，CRISPR-Cas9可允许干细胞或受精卵中的多个基因诱变，并产生在F0代具有明显表型的双等位基因突变体，用于研究基因功能，而不用跨越几代对动物进行杂交。然而，到目前为止，这两种方法都没有被应用于鲤鱼研究。
在这项研究中，该研究小组采用TALEN和CRISPR-Cas9技术，来修改与骨形成有关的基因，如sp7基因——一个含有锌指的转录因子，在成骨细胞中表达，它能激活前成骨细胞分化为成熟的成骨细胞和骨细胞。此外，研究人员使用这两种技术，修改与骨形成相关的其他基因，包括runx2基因（runt相关转录因子2）——调节成骨细胞分化和骨发育的一个关键转录因子；spp1（分泌磷蛋白1）——参与骨矿化的一个后期成骨细胞特异性标记；opg（骨保护素）——参与影响破骨细胞形成的一个骨保护分子；和bmp2（编码骨形态发生蛋白2），从而促进runx2和sp7的表达，并诱导表达spp1、骨钙素等成骨基因的表达。
该研究小组还使用这两种系统来修改mstnba——转化生长因子-β超家族的一个成员，以及骨骼肌生长的一个负调控因子。与野生型小鼠相比，Mstn基因敲除小鼠，在肌纤维的大小和肌细胞数量上显示出2到3倍的增加。
这些研究结果表明，mstnba-CRISPR和sp7a-CRISPR突变的鲤鱼，表现出肌肉或骨骼缺陷。研究人员还以很高的效率在鲤鱼中产生了mstnba; sp7a的双突变体。总之，这些结果表明，TALEN和CRISPR-Cas9系统，都是鲤鱼遗传学研究和育种的有效的基因组编辑工具。
本文来源于：生物通/王英
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