3.3 lncRNA的一般研究策略

1 LncRNA的一般研究策略

图1 LncRNA的一般研究策略

(1)LncRNA筛选

通过lncRNA芯片或RNA测序等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA表达谱分析;通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA，构建共表达网络，预测lncRNA的靶基因;通过PCR或Northern Blot技术对候选lncRNA验证，确定其表达差异。

(2)LncRNA全长克隆

可以通过5'RAce获取lncRNA 5'全长，3'RACE获取lncRNA 3'全长，最终拿到完整的lncRNA序列。

(3)表达分析

细胞水平表达：在细胞水平进行检测表达差异。

组织分布：检测不同组织、不同阶段表达特性。

表达水平动力学变化：比较不同处理条件下，如药物处理、诱导处理下，表达水平差异。

(4)功能研究

功能获得性研究：构建lncRNA过表达载体。

功能缺失性研究：可通过siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA，干预 lncRNA后检测其对疾病相关基因表达影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响。

可通过RNA pull down、RNA-RIP、ChIRP-seq等方法检测与lncRNA结合的DNA、RNA、蛋白质。

表达调控：将lncRNA表达与其他领域相结合，解释lncRNA调控机理。

转录因子：研究lncRNA与转录因子的调控机制。

染色质重塑：lncRNA表观调控。

ceRNA机制：研究lncRNA-miRNA-mRNA三者之间的调控机制。

2 LncRNA的一般研究实验手段

图2 LncRNA的一般研究实验手段

(1)与蛋白质的相互作用

识别lncRNA的蛋白质伙伴，可以为它们的功能的机制和路径提高线索。RIP技术，如chemical-cross-linked RIP、native RIP (nRIP)、UV-crosslinked immunoprecipitation (CLIP)使用抗体来pulldown核蛋白复合物，然后从中分离相关RNA用于分析。每个变体都有它各自的优势和缺陷。nRIP提供交联产物，而CLIP在避免交联产物的重新组合的同时用于识别RNA与蛋白质相互作用位点。这些技术可以结合高通量测序，如RIP-Seq、HITS-CLIP/CLIP-Seq，来识别lncRNA相互作用的全部宿主蛋白质因子，尽管还需要技术手段的确认。

(2)与DNA的相互作用

有几个实验技术被用于识别lncRNA的基因组靶位点。以染色体免疫共沉淀(ChIP)和RIP技术的原理为基础，使用染色体RNA免疫共沉淀(ChRIP)来识别与特殊染色体标签相互作用的RNA。另一方面，chromatin oligo-affinity precipitation (ChOP)、chromatin isolation by RNA purification (ChIRP)、capture hybridization of RNA targets (CHART)使用标记的互补寡核苷酸来识别与目的RNA相互作用的DNA位点。

图3 ChIRP基本实验流程

(3)结构特征

lncRNA可以形成特殊的二级和三级结构来执行它们的功能。通过selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE)和in-line probing来获得局部核苷酸柔性。SHAPE可用于高通量分析，如SHAPE-Seq，连接其它依赖于RNA酶消化的技术，如fragmentation sequencing (FragSeq)和parallel analysis of RNA structure (PARS)。

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作者：广州赛诚生物