3.5 RNA pull- down实验流程

问题1：RNA 降解

可能原因：1)无核酸酶的环境被破坏

2)体外转录的RNA探针降解

解决办法：1)清洗和使用新开的离心管和试剂等

2)RNA探针合成后，电泳检测其长度和浓度

问题2：RNA结合蛋白的亲和力不够：

可能原因：1)结合缓冲环境没有优化

2)裂解不完全

3)磁珠用量不足

4)RNA探针用量不足

解决办法：1)优化孵育时间、温度、盐浓度等条件

2)增加裂解液和蛋白上样量的比例

3)增加裂解液

4)增加磁珠用量

5)增加探针用量

6)确定生物素和链霉亲和素效率

问题3：RNA结合蛋白没有结合

可能原因：1)靶蛋白量不足

2)缓冲体系不对

3)RNA探针和蛋白的亲和力本来就低

解决办法：1)增加上样蛋白量

2)应用低盐体系

3)加入交联试剂

问题4：结合的非特异性高

可能原因：1)缓冲环境没有优化

2)缓冲环境严谨性低

3)样品没有裂解完全和裂解体系没有优化

解决方法：1)优化孵育时间温度盐浓度等条件

2)使用严谨性高的缓冲体系

3)调低RNA探针和样品的比例

4)提高裂解液的量

问题5：WB信噪比高

可能原因：1)阳性信号率低

2)一抗效率低

3)蛋白没有充分溶解

解决方法：1)增加二抗的量

2)用敏感度的化学发光液

3)用细胞裂解液预孵一抗

4)增加样品的量

5)确定有没有其他可能的结合情况

6)增加裂解液用量

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作者：广州赛诚生物