3.8 荧光素酶检测技术（Luciferase ）实验常见问题

荧光素酶报告基因检测法是转录调控研究中十分重要的实验手段。但其结果往往存在一定的误差。为解决这一问题，现普遍采用双荧光素酶报告基因检测法。在双荧光素酶报告基因测试中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而对照报告基因作为内对照，以使实验报告基因测试的结果归一化。作归一化可消除实验过程中减弱实验准确度的变化，如培养细胞的数量、细胞转染及裂解的效率等。在研究转录调控启动子活性中，具体实验步骤如下。

1 质粒转染细胞

1.1 细胞铺板：将细胞按70%的汇合度接种到96孔板。

1.2 转染：16h后转染萤光素酶报告基因质粒和RNA，每个样品设置6个复孔

(1)配制DNA和转染试剂: 96孔板转染质粒时每孔比例为pLenti：Firefly：Renilla：转染试剂=0.2μg：0.1μg：0.01μg：0.25μL

(2)稀释好DNA及转染试剂，常温孵育5min

(3)将稀释好的DNA分别和转染试剂混匀，常温孵育20min

(4)每孔弃去15μL培养基，将15μL DNA转染混合液添加到每孔细胞样品中

(5)转染6h后，换新鲜完全培养基

2 双报告基因检测

(1)质粒共转染48h后，弃去培养基，用100μL 1XPBS洗1遍

(2)倾斜96孔板，吸干剩余的PBS

(3)去离子水将5XPLB稀释成1XPLB，使用前放到常温

(4)每孔加50μL稀释好的1X PLB，摇床常温条件下摇15min，进行裂解

(5)白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤4的上清液10μL，加入100μL预先混好的LAR II，2s后测数据

(6)每孔添加100μL预先混好的Stop&Glo Reagent，静止2s后，测数据

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作者：广州赛诚生物