植物生物钟与关键农艺性状调控

作者谢启光，徐小冬，单位：河北师范大学生命科学学院

摘要：生物钟参与调控植物体几乎全部的生长发育和新陈代谢过程，赋予植物体“预知”外界环境条件变化的能力，使得其生理生化反应与外界环境达到时空同步，从而获取更多的资源，减少能量消耗，增强植物体环境适应性和竞争能力。现概括介绍了植物生物钟领域的最新研究进展，包括由核心调控组分构成的多重转录-翻译反馈环路，特别强调了生物钟输出途径的研究成果，以期促进生物钟基础理论研究应用于农业生产的可行性探索。

自然界在漫长的演化过程中，由于地球的自转引起各类环境因子产生近24小时的节律性变化，如日照长度变化(光周期)和昼夜温度变化(温度周期)等。在原始地球环境中，还可能存在着强烈的紫外线的昼夜节律性变化。所有这些情况都会对生命体的生存产生选择压力，因此，从部分原核生物到真核生物，如动物、植物、真菌，以及一些细菌、蓝藻等诸多生命形式，为了协调生物体自身生长发育和各类环境信号的昼夜变化，分别独立进化出不同的内源性时间调控机制去适应环境中的24小时周期节律现象，从而保证物种的生存和繁衍，使生物个体可以节省或避免资源和能量的损失，从生物钟的调节机制中获益。这种殊途同归的进化方式，也从一个侧面说明了生物钟对于各类生物体适应性生存的重要意义。

生物钟的研究摆脱经验性阶段，正式采用科学的方法起始于对植物体周期节律现象的观测。1720年，DeMairan通过实验证实，在持续黑暗条件下，含羞草叶片开合现象依然保持着如同昼夜周期下同样的节律性。植物生物钟和其他生物钟领域的研究工作相互借鉴和促进，共同经历了生物钟基本特性的确立和时间生物学学科的成型以及逐步缓慢发展阶段，可以称为生物钟研究的厚积阶段。随着生物钟理论的逐步明晰，和新的生物学技术方法不断引入生物钟研究领域，近些年进入了井喷阶段。在植物生物钟核心循环调控机制方面，陆续发现了一系列新的调控组份，阐明了新的分子作用机制，同时也纠正了过去一些不确定的观点和结论；在生物钟的输出途径研究方面，陆续发表的高水平研究成果揭示出生物钟以及周期节律对植物体光合效率、生物量、杂种优势、生物和非生物逆境胁迫的抗性以及农产品收获后的贮藏等重要农艺性状具有关键调控作用，展现出生物钟及周期节律研究对农业生产具有重要的理论价值和广泛的应用前景。生物钟的整体调控是从基因组水平上对生理生化途径关键基因的调控开始，进而影响到植物生长发育的不同时期和进程，如植物开花、生长和衰老、组织器官的节律性生长、花瓣开合、叶片运动、茎的环绕运动、气孔开闭和叶绿体等细胞器的运动；在生理生化方面，生物钟调控着植物激素的节律性表达和降解以及应答反应、细胞游离钙离子浓度的周期性振荡、蛋白质磷酸化和其他修饰过程。总而言之，植物生物钟从“纤毫”到整体调控着植物诸多生化和分子信号途径，处于“高屋建瓴”的地位。由于不同类型物种的生物钟都是独立进化而来，因此，植物与人类、斑马鱼、果蝇、蓝藻和脉孢菌等其他模式物种相比，生物钟的关键调控组分有明显不同，但是植物生物钟依然遵循着3个主要特征规律。第一，生物钟节律独立于外界环境信号的周期性变化(光暗周期、温度周期等)，其产生是内源性的，在持续条件下(例如持续光照、恒定温度等)可以自主地以近24小时为周期振荡，或者可以说生物钟调控系统是遗传得来的，由细胞内自身的组分来控制，使得生物体能够具有“预测”时间和外界环境周期性变化的能力。第二，生物钟调控的节律可以被环境中的信号(如光、温度等)所引导和重新设定，如同我们旅行到地球另外一个时区要矫正随身携带的手表一样，生物体自身的节律也可以被调节去更好地适应外界环境。第三，生物钟调控的节律具有温度补偿现象，节律性振荡的周期在一定温度范围内始终维持在近24小时。这就意味着对于大多数生理反应的温度系数Q10大于2(例如温度每升高10度，酶促反应速度相应提高1倍)在生物钟控制的节律中并不成立，其节律的Q10接近1，在一定温度范围内生物节律性可以维持稳定状态。此外，植物生物钟调控的节律性振荡的周期长短与光照强度成反比关系，即随着光强增加，自由振荡的周期缩短。本文将按照生物钟系统传统的三部分组成：输入途径、生物钟核心振荡器、输出途径，来介绍植物领域的研究进展。

1“蝴蝶效应”——植物生物钟的输入途径

生物钟输入途径主要包括两个重要的环境因子——光照和温度。自然环境中，植物生物钟处于每天节律性变化的外界环境因子(特别是光照和温度)的影响下，在植物整个生长发育进程中，机体感受到外界光照长短和温度高低等的变化，不停地重新校对生物钟，使之与环境变化同步。这里的光和温度等的一次昼夜变化，正如“蝴蝶翅膀的一次扇动”。植物通过生物钟系统的输入途径可以感知外界环境的变化，进一步通过生物钟核心调控和下游信号途径的网络级联反应，最终产生与之适应的生化和分子功能的变化。

对于植物生物钟输入途径的研究主要集中在光照和温度两种环境信号上，相关工作涉及到红光受体光敏色素、蓝光受体隐花色素和其他光受体以及相关的光信号转导组分方面。拟南芥有5种光敏色素、2种隐花色素，其他相关的光信号转导组分有PIFs因子、ELF3、ELF4、FHY3、DET1和HY5，但是除了几篇关于光受体对生物钟影响的研究论文外，光受体下游组分对生物钟系统的调控方式目前知之甚少，目前根据已有的结果很难拼出整体调控框架。此外，ZTL家族成员之一的ZTL也被证明是和生物钟紧密相关的蓝光受体，ZTL在蓝光调控下影响TOC1的稳定性。ZTL的LOV结构域可以和TOC1、PRR5结合，然后通过蛋白酶依赖的降解途径降解掉TOC1和PRR5。然而，蓝光可以诱导ZTL的LOV结构域的构象变化更加倾向于结合GI，从而保护TOC1、PRR5和ZTL在夜晚之前不被降解。GI除了能够与ZTL相互作用，稳定ZTL不被降解外，也与生物钟系统的温度补偿机制密切相关。上述生物钟相关组分承担着感受外界光信号的变化，并将这种变化传导给生物钟核心循环，使之能够迅速地重新设定生物钟系统。目前研究结果表明，隐花色素在温度感受中也起了重要作用。蓝光受体除了在光敏色素下游起一定的作用外，还独立于光敏色素的途径，并且在温度补偿过程中起重要的调节作用。尽管目前对于光信号如何传导到生物钟还不清楚，但是已经确定了生物钟系统内部对光信号响应的基因，包括：CCA1、LHY、PRR9和GI等。环境温度对生物钟系统的影响主要集中在温度补偿现象，此方面的研究结果较多，但是温度补偿机制似乎比较复杂，目前比较确定的是CCA1、LHY、TOC1和GI等基因对温度变化比较敏感，遗传学分析结合基因表达分析表明，CCA1在低温情况下起主要作用，而LHY在高温情况下发挥着更重要的功能。此外，温度还通过影响mRNA的拼接机制来进一步作用于生物钟系统，在gi突变体和prr7prr9双缺失突变体中对于该机制参与温度补偿现象的研究比较深入。除了光和温度外，氮营养和铁微量元素也在生物钟系统输入途径中显示出重要作用。氮源对生物节律的相位响应曲线结果表明，在不同时间处理会导致CCA1表达节律的相位延迟或提前，说明氮源做为植物体重要的营养元素，在生物钟输入途径中也起着重要作用。在微量元素铁缺乏时，导致生物节律的周期延长，对生物钟突变体在不同程度铁供应的情况下，以及铁相关突变体的生物钟表型变化的研究表明，铁稳态代谢和生物钟系统之间存在着应答反应。

2“中庸之道”——植物生物钟的核心调控网络

随着对植物生物钟研究的深入，越来越多生物钟核心作用组份和影响生物钟的相关基因被报道出来，随着对这些基因的转录、转录后调控机制的研究，生物钟核心循环早已经从最初简单的负反馈循环逐步发展成多重负反馈循环模型，进而逐步演化为目前复杂的调控网络。生物钟调控模式不同于其他信号转导的级联式的调控方式，生物钟总体上必须要维持相对稳定的平衡状态以保证植物获得生存的最大利益。正因为如此，可能在进化过程中，生物钟选择了这种相互拮抗的、反馈式的复杂网状调控模式，使得植物在内外环境信号的周期性变化过程中，生物钟系统保持相对稳定，维持机体正常的生长和发育。环境因素的变化需要植物生物钟核心调控网络具有较强的补偿效应，使得生物钟能够保持“中庸”状态，行使功能。

对以双子叶模式植物拟南芥为代表的高等植物生物钟的研究结果进行分析，发现其不同于其他物种的一个重要特征就是涉及到的生物钟核心组分和相关基因很多，它们之间形成复杂的转录水平上的反馈调控网络，而且还涉及到mRNA拼接、蛋白质磷酸化修饰、蛋白质复合体、核定位和蛋白质降解等转录后调控机制。

在生物钟调控网络中，最突出的特点就是在拮抗中保持平衡状态。生物钟在外界环境变化时保持相对的稳定对植物的生长尤为重要。清晨出现表达高峰的生物钟核心基因——CCA1和LHY，它们在功能上有很大程度的互补性。作为Myb转录因子，CCA1/LHY对同样出现在清晨表达高峰的基因PRR9/PRR7具有促进作用，但对于傍晚或夜间表达高峰的基因PRR5和TOC1起抑制作用。RVE4/RVE6/RVE8，同样作为Myb转录因子，功能可能部分互补，对PRR9/PRR7、PRR5和TOC1起转录促进作用。而PRRs，按照转录本表达高峰出现的顺序依次是PRR9、PRR7、PRR5、PRR3(维管组织特异性表达)和TOC1(PRR1)，则作为转录抑制因子使CCA1/LHY或者RVE8等基因的表达下调。因此，PRRs基因出现在CCA1等清晨表达高峰基因的转录峰的下降区段。生物钟系统中在夜间起关键调控作用的傍晚蛋白复合体在受到CCA1/LHY抑制的同时，也受到RVE8等的激活调控，ELF3/ELF4/LUX构成的蛋白质复合体同时反馈性地抑制CCA1/LHY和RVE8等的转录。近些年对于早晨调控机制仅限于针对单个早晨表达基因和蛋白质的表达和调控研究，缺乏对于早晨蛋白质复合体的调控机制的综合研究。最新发表的关于LNK1/LNK2调控机制的研究表明，LNK1/LNK2与早晨蛋白CCA1/LHY/RVE4/RVE8直接相互作用，同时具备转录激活活性，可能起到关键的桥梁作用，该工作对于早晨蛋白质复合体的确立起到了重要作用。综上所述可以看出，生物钟的核心组份间始终处于相互拮抗的调控状态，正是这种调控方式使得生物钟节律不会偏离24小时太远。在正常的昼夜节律下，外界环境因子可以为植物校对生物钟提供依据，保证不会出现大的偏差。

转录后水平的调控在生物钟机制中也尤为重要，其中关键组分的磷酸化是一种重要调控方式。CK2激酶在生物钟系统中的作用得到了较好的研究，ckα1ckα2ckα3三突为长周期突变体，而超表达CKβ3或CKβ4则导致周期缩短，α和β亚基主要可能通过磷酸化CCA1来调控生物钟的功能。生物钟关键组分PRRs的磷酸化状态也决定了它们的稳定性和亚细胞定位，在这方面，ZTL与PRR5和TOC1的相互作用，以及PRR5和TOC1的相互作用提供了极好的例证。2013年，Wang等还证明了PRR5、PRR7、PRR9通过与TOPLESS/TOPLESS-RELATED家族蛋白相互作用，从而抑制CCA1和LHY的表达。mRNA的选择性拼接是另一种重要的转录后调控机制，CCA1、PRR9等关键基因都表现出了受生物钟调控的选择性拼接方式，PRMT5、SKP1和STIPL13个拼接相关的基因研究结果揭示了RNA拼接机制在生物钟调控中的重要作用，似乎影响拼接效率的最终结果是导致生物钟周期延长。近些年的植物生物钟的研究开始更加精细地分析生物钟的组织特异性情况，根的生物钟被认为比叶生物钟调控网络更加简化，但是叶生物钟通过某种机制可以影响到根生物钟的模式。对于叶肉细胞和维管束组织生物钟的关系研究结果也让人耳目一新，相比叶肉组织，维管束组织生物钟似乎对于生物钟调控的开花等生理过程具有主导调控效应。

3“天人合一”——生物钟的输出途径与植物的环境适应性

“天人合一”是中国古典哲学的根本观念之一，可以帮助我们理解生物钟与植物环境适应性的反馈调控关系。“天”这里指自然环境因素，具体来说就是前面所提到的输入途径的重要因素：光照、温度、营养、环境中生物和非生物胁迫等很多环境因子都有昼夜节律性；“人”这里借指植物和其受生物钟调节的生理生化输出途径；“合一”这里指受生物钟调节的输出途径与环境变化因素的同步化。在漫长的进化历程中，生命体为了适应自然界的周期性变化，进化出的一套内源性适应机制——生物钟。生物钟的存在使植物能够对外界环境的变化“未卜先知”，从而节省能量消耗，减少损失，获得生存的最大利益。

植物生物钟的输出途径众多，几乎包括了植物生理生化、发育和代谢过程的所有方面，主要是由于生物钟调控着上述过程的关键基因，这一点可以从芯片数据中得到证实，即使设定了很高的分析门槛，也有将近10%以上的基因受生物钟调控，几乎囊括了各个生理过程和信号通路的关键基因。

生物钟调控的细胞质游离钙离子浓度的24小时振荡节律是种特殊的生化水平的输出途径。作为植物细胞中最重要的第二信使之一的钙离子，在植物的生长发育和许多逆境信号转导过程起着重要作用。陆续的研究表明，钙振荡受红光和蓝光的共同调控，光受体在其中起了不同的作用。红光途径主要通过PHYB介导，CRY1、CRY2双重介导了蓝光途径，蓝光对细胞质中[Ca2+]cyt水平的提升调控需要PHYB、CRY1、CRY2的共同参与。ELF3在其中起到了如同阀门的作用，直接通过控制生物钟的光输入途径来调节细胞内游离钙离子节律。

目前研究表明，生物钟调控的气孔开闭和下游靶基因的节律性表达对于植物抗病性非常重要。生物钟调控的靶基因中很多直接或间接参与了基本防御反应和R-基因介导的抗性反应，使得植物可以预测到病原菌的侵染时间，有针对性地调动相应的防御基因开始表达。同时，气孔开闭的时间调控对防止病原菌的侵染也至关重要，其中CCA1和LHY在生物钟帮助植物应对生物胁迫反应中可能起到关键作用。以拟南芥为材料的实验还证明了植物可以通过生物钟“预测”昆虫的取食行为，通过调动茉莉酸介导的防御反应与昆虫做斗争。2012年和2013年，Goodspeed等研究揭示，对采摘后各种蔬菜和水果进行昼夜性的节律处理可以大大提高蔬果对害虫的抗性。活性氧是植物体内代谢产生的一类含氧基团，在植物的生长发育、基因表达调控和生物与非生物胁迫反应中担负着重要功能。Laia等研究表明，CCA1和其他生物钟基因参与ROS反应相关基因的表达调控，CCA1可能作为一个主要调控因子，通过结合到ROS相关基因启动子上的顺式元件，调控它们的节律性表达。

生物钟核心组份及其调控的靶基因在非生物胁迫反应中也起了一定的作用。prr5prr7prr9三缺失突变体植株中ABA合成途径关键基因的表达显著上调，导致ABA含量明显高于野生型，暗示PRR5/PRR7/PRR9可能在植物适应低温、高盐和干旱胁迫中也起到了重要作用。Legnaioli等研究表明，ABA可以上调TOC1(PRR1)，TOC1也可以通过直接结合ABAR启动子区调控ABAR的周期性表达，因此TOC1被认为在干旱胁迫信号途径和生物钟之间起到分子开关的作用。对PRR7靶基因的分析表明，许多PRR7调控的靶基因同时受到ABA调控，通过对PRR7基因的突变体、超表达及野生型植株对ABA响应的分析，推测PRR7至少部分参与了ABA的时间依赖性信号转导反应。另一个生物钟重要组分GI也被证实通过与SOS2相互作用进而调控盐胁迫反应。在没有胁迫的情况下，GI/SOS2复合体阻止SOS2激活SOS1；盐胁迫可以诱导GI的降解，与GI解离后的SOS2可以激活下游反应；GI的上述功能也为解开胁迫和开花之间的关系提供了很好的一个线索。随着GI参与诸多生理过程研究结果的发表，GI有成为一个研究生物钟调控不同输出途径的新热点的趋势。

除了在模式植物中证实生物钟对杂种优势和开花调控等的重要作用外，生物钟机理的研究在农作物上也逐步展开。目前主要是根据基因的同源
性在水稻、大豆等主要作物中克隆并验证了一些生物钟相关基因的功能。随着理论研究的深入，生物钟将会在农业生产若干领域，诸如杂种优势的利用、高产高效优质品种的培育、提高作物抗性、拓展作物的地域性、调控花期和提高有用器官的生物量等方面，发挥积极的作用。（参考文献略）

徐小冬，博士，教授。2009年起作为河北师范大学“细胞生物学国家重点学科”海外人才引进，特聘教授，博士生导师。研究方向为植物周期节律与生长发育调控：研究以24小时为周期的生物节律参与植物生长发育和环境适应性调控的作用机制。在细胞跨膜信号转导、生物钟转录水平调控机理、胞质游离钙离子昼夜节律的分子机制、生物钟基因的选择性拼接机理、农作物生物钟系统定量遗传学，以及建立LCI、BRET实时、活体跟踪观察蛋白质的单细胞水平的互作等研究中均有成果发表。