如何测人体最大微生态库？下一代测序来帮忙

在人体中最大的微生态库是生活在人体消化道微生物复合群落组成的肠道菌群，别看人体肠道所占体积不大，但是人体肠道内寄生着10万亿个细菌，它们能影响体重和消化能力、抵御感染和自体免疫疾病的患病风险，还能控制人体对癌症治疗药物的反应。

人体肠道的正常微生物，如双歧杆菌，乳酸杆菌等能合成多种人体生长发育必须的维生素，如B族维生素（维生素B1、B2、B6、B12），维生素K，烟酸、泛酸等，还能利用蛋白质残渣合成必需氨基酸，如天冬门氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和苏氨酸等，并参与糖类和蛋白质的代谢，同时还能促进铁、镁、锌等矿物元素的吸收。这些营养物质对人类的健康有着重要作用，一旦缺少会引起多种疾病。

最新研究表明慢性疾病，如肥胖症，炎性肠病（IBD），糖尿病，代谢综合征，症状性动脉粥样硬化和非酒精性脂肪肝疾病，都与肠道菌群密切相关。许多国内外的相关研究由此开展，像欧盟的胃肠道元基因组计划（MetaHIT），该计划的目标是建立肠道菌群基因与人类健康疾病的关系，像美国2008年推出的人体微生物组计划（HMP），为期五年，1.15亿美元的总预算。这个项目的最终目标是测试人体菌群变化，以及其与人类健康或疾病的关联性。

在中国，国家批准了感染性疾病相关肠道微生物的研究计划。该项目的目标是利用系统生物学，包括宏基因组学和代谢组学的方法研究感染性疾病的肠道微生物变化。

在这里，特别值得注意的是宏基因组学，宏基因组学（Metagenomics）又叫微生物环境基因组学、元基因组学，它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA，构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。

也就是说，我们要使用宏基因组学这个方法来研究肠道微生物变化，这个任务是非常艰巨的，至少在下一代测序发明之前，是不可想象的。

凡是在实验室使用过一代测序--Sanger法测序的同学都知道，往往为了测一小段DNA，首先要将样品扩增，全部过程下来，大半天的时间是起步价，如果以这个速度测肠道菌群的宏基因组学所需数据，那估计穷极一生，我们也是不肯能完成这个任务的。

工欲善其事，必先利其器，那么下一代测序又是怎样完成全部测序任务的呢？

下一代测序不需要进行PCR扩增，以Helico BioScience 单分子测序技术为例，该测序是基于边合成边测序的思想，将待测序列随机打断成小分子片段并用末端转移酶在 3' 末端加上 poly(A)，以及在poly(A)的末端进行荧光标记和阻断，把这些小片段与带有poly(T)的平板杂交成像来获得已经杂交模板所处的位置，建立边 合成边测序的位点 加入聚合酶和被Cy3荧光标记脱氧核苷酸进行DNA 合成，每次只加入一种脱氧核苷酸，然后将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱，直接对Cy3成像，观测模板位点上是否有荧光信号，然后化学裂解核苷酸 上的燃料并释放 加入下一种脱氧核苷酸和聚合酶的混合物，进行下一轮反应。

有此利器在手，测肠道菌群的宏基因组当然不在话下。

在前期研究中，浙江大学感染性疾病协同创新中心研究员秦楠，负责的实验室通过定量宏基因组技术对98个肝硬化病人和83个健康人的肠道菌群进行了研究。建立了第一个肝硬化参考基因集，包括269万基因，其中36.1%为新基因；肝硬化患者和健康个体之间基因丰度存在差异，可将它们分为66个代表同源细菌物种的组群，其中28个组群丰富地存在于患者体内，38个组群丰富地存在于对照个体中。第一次发现肝硬化患者体内存在大量细菌起源于口腔；首次找到一种由15个基因构成的生物标记物，建立了肝硬化菌群失衡诊断的新标准（PDI指数），并在一个独立组群中进行了验证，可作为肝硬化诊断的强有力工具，该研究内容于2014年7月在Nature杂志上发表。

此次生物谷召开的2015 下一代测序发展论坛：行业探讨与临床应用，就有幸邀请到了秦楠博士同我们分享下一代测序在临床应用研究中发挥的巨大作用。我们热忱欢迎您的参与，与来自测序行业的企业单位，研究机构的14位嘉宾共同探讨下一代测序的行业发展，临床应用！

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