PNAS：中外高校合作研发一种优化Cas9/sgRNA系统高效编辑果蝇基因

清华大学医学院和哈佛医学院等处的研究人员合作开发了一种优化的Cas9/sgRNA系统，结果表明这一优化系统在果蝇基因编辑中是高效、特异且廉价的，可以很容易地以半高通量方式投入应用。相关文章发表于2013年11月4日的《PNAS》杂志上。

中外高校合作研发一种优化Cas9/sgrna系统高效编辑果蝇基因

背景

近几年来，科学家一直在寻求更加精确的方法对特定的基因进行敲除或靶向修饰。通过在基因组水平上进行精确的基因编辑，可以更加准确、更加深入地了解疾病发病机理和探究基因功能，找到遗传性疾病治疗的有效手段，因此，基因组编辑具有极其广泛的发展前景和应用价值。

2011年末，人工核酸酶介导的基因组编辑技术被《Nature Methods》杂志评为年度最受关注的技术。从当年的技术发展看，经过基因工程改造的核酸酶主要包括3个类型：锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)和归巢核酸内切酶(engineered meganucleases)。

目前ZFN以及TALEN已被广泛应用，而归巢核酸内切酶由于改造难度大、成本高，使其应用有所局限。近期，细菌获得性免疫系统CRISPR在人源细胞染色体修饰上的应用使得基因组编辑技术进一步简化。

Cas9/sgRNA系统技术优化

CRISPR/Cas是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR被分为三个主要类型，内切核酸酶Cas9属于研究最深入的II型CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas依赖于Cas9，通过单导向RNAs(single- guide RNAs，sgRNAs)可在特定的位点切割DNA。

近期的一些研究证实这一简单的Cas9/sgRNA系统可在许多生物中实现基因组工程操作。

研究人员开发了一种高效、廉价、优化的Cas9/sgRNA技术。

他们特异性靶向果蝇生殖细胞生成了可遗传的突变体等位基因，构建出了借助于nanos启动子、生殖细胞系稳定表达Cas9的转基因果蝇。随后他们将U6b启动子控制下、编码短sgRNAs的质粒DNAs注入到这些转基因果蝇体内，对果蝇进行了基因组DNA编辑。就诱变的效率比较了不同的启动子和sgRNA支架。

通过筛查所有后代中突变后代的数量，确定这一优化系统达到了74.2%的总诱变率。他们评估了与这种方法相关的脱靶情况，建立了一个网络资源和一个可检索的、全基因组数据库，可用于预测果蝇基因组工程操作适当的sgRNAs。最后，研究人员还探讨了新方法相比于近期发表的一些其他方法的优势所在。

清华大学医学院的倪建泉(Jian-Quan Ni)博士、许江(Jiang Xu，音译)以及哈佛医学院的Norbert Perrimon博士是这篇论文的共同通讯作者。倪建泉的主要研究方向包括利用第三代转基因敲除技术构建果蝇模式动物平台;筛选影响消化到免疫和干细胞的蛋白因子;研究miRNA、ncRNA的功能。

原文摘要：

Optimized gene editing technology for Drosophila melanogaster using germ line-specific Cas9

Xingjie Ren, Jin Sun,Benjamin E. Housden, Yanhui Hu,Charles Roesel, Shuailiang Lin,Lu-Ping Liu,Zhihao Yang, Decai Mao, Lingzhu Sun,Qujie Wu, Jun-Yuan Ji, Jianzhong Xi,Stephanie E. Mohrb, Jiang Xu,Norbert Perrimon and Jian-Quan Ni

The ability to engineer genomes in a specific, systematic, and cost-effective way is critical for functional genomic studies. Recent advances using the CRISPR-associated single-guide RNA system (Cas9/sgRNA) illustrate the potential of this simple system for genome engineering in a number of organisms. Here we report an effective and inexpensive method for genome DNA editing in Drosophila melanogaster whereby plasmid DNAs encoding short sgRNAs under the control of the U6b promoter are injected into transgenic flies in which Cas9 is specifically expressed in the germ line via the nanos promoter. We evaluate the off-targets associated with the method and establish a Web-based resource, along with a searchable, genome-wide database of predicted sgRNAs appropriate for genome engineering in flies. Finally, we discuss the advantages of our method in comparison with other recently published approaches.

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