基因测序助力“液体活检”大放异彩！
2015年CSCO大会刚刚落下帷幕，精准医疗当仁不让的成为吸引近2万名与会者讨论的热门话题，而热门中的热门又当属“液体活检”。通过几天的大会观察 发现，临床专家几乎是一边倒的看好液体活检在临床中的应用，其在肿瘤早筛、肿瘤用药、疗效评估和复发监测方面的研究进展无不让大家拍手叫好。
9月24日，Cell Press旗下的《Trends In Genetics》刊发约稿文章《Accessing Genetic Informationwith Liquid Biopsies》，邀请多位国内外知名的转化医学研究专家为“液体活检”的临床应用把脉，作者包括中国工程院院士、中国协和医科大学副校长詹启敏教授，美国MD Anderson Cancer Center的FilipJanku教授，以及Illumina公司前资深技术总监、广州基准医疗公司（AnchorDx）创始人范建兵博士和AnchorDx技术总监蔡绪雨博士。文章结合二代测序（NGS）技术最新进展，将注意力集中在“液体活检”在未来分子诊断中的应用前景，同时也深刻的剖析了我们所面临的挑战。
在未来，哪种液体活检样本会脱颖而出？
前景有待证明的cfRNA/circulating miRNA
针对mRNA和miRNA的研究已持续多年，时而出现的几篇重磅性文章一直使其处在大家视线之中。但现实又如何呢？一方面我们需要通过定量分析mRNA和miRNA来诊断疾病；而在血液中，肿瘤细胞释放的少量cfRNA很难准确检出，因此实际应用在临床的检检并不多。如果未来的技术可以实现高效富集疾病特异的外泌体或其他类型囊泡，它们的诊断价值也许可以得以体现。
前景不容乐观的CTC
近两年，循环肿瘤细胞（CTC）在国内的临床应用呈快速上升的趋势，应用较广泛的是利用CTC数量评估部分癌种预后（FDA及CFDA批准的适应症），同时也有学者尝试根据CTC数量动态变化评估化疗疗效或改变治疗策略，分离CTC进行体外药敏试验，或者基于NGS技术进行CTC单细胞测序，进而指导肿瘤个体化治疗。但CTC在血液中的数量稀少（～1个CTC/10^9白细胞），阳性率低（晚期肿瘤患者＜85%)，肿瘤患者个体间CTC数量差异大。除（乳腺癌）预后评估，在疗效评估方面的大型临床试验结果暂无阳性结果，比如2013年SABCS汇报的SWOG S0500临床试验就是一个失败的例子。此外，CTC的临床应用还有待于CTC捕获技术和分析技术的双重突破。
前景看好的cfDNA（cell-free DNA)
外周血中游离的核酸小片段DNA源自正常细胞或肿瘤细胞代谢与凋亡，具有极大的临床应用价值。其中临床应用最为成功的是我们熟知的NIPT产品;它也是第一个基于NGS技术的临检产品，在灵敏度和特异性方面显著优于常规产前筛查技术。肿瘤方面，多项研究显示外周血中ctDNA（circulating tumor DNA）的含量与肿瘤负荷及疾病进展相关；通过NGS对ctDNA进行定量分析，可以评估肿瘤大小，实现疾病实时监测。其次，在肿瘤早期筛查方面，多项研究证明ctDNA在肿瘤早期已经存在于外周血中，若与高灵敏度检测技术结合，将有非常好的肿瘤早期筛查和残留微病灶（MRD）检测潜力。
除此之外，利用ctDNA检测肿瘤驱动基因，指导实时个体化治疗是当下热点。以肺癌为例，临床中有30%以上的肺癌患者没有足够的肿瘤组织样本可用来进行基因检测，错失靶向治疗机会，而ctDNA正好弥补这一临床缺口。有研究表明从晚期癌症病人ctDNA与组织样本中得到的检测结果总体吻合率在80%左右，因而液体活检已获得临床和相关机构认可，比如欧盟于2014年批准了阿斯利康易瑞沙（Iressa）血液ctDNA伴随诊断，用于筛查受益人群。ctDNA还可以用来进行耐药监测。随着二代测序技术的快速发展，技术灵敏度和特异性不断提高，最先借着风口，实现弯道超车的非ctDNA莫属。
液体活检走到临床，还有哪些问题需要解决？
1、开发高灵敏度、高特异性检测方法，包括技术平台建设，实验方法创新及大数据分析，实现对循环肿瘤细胞/cfNA的高效分离及准确的鉴定和分析。
基因突变、表观遗传学变化和基因差异表达是个体化诊疗的主要检测目标。对应的检测技术包括等位基因特异PCR、甲基特异PCR，芯片技术和NGS；其原理和技术参数均有不同。在临床应用中，只有很好的将样本类型与相关检测技术相匹配才能获得最优化的临床产品。以体细胞基因突变检测为例，外周血中ctDNA占总cfDNA的<0.1‰–>50%，这就要求应用液体活检标本进行驱动基因检测的技术和产品满足至少两个条件：1，高灵敏度、高特异性；2，可并行检测体细胞基因单一位点突变、基因扩增和融合等多种突变类型，降低样本用量。
综合分析当前常用技术不难发现，真正符合这一要求的技术并不多，如常用的等位基因特异PCR技术灵敏度在1-10%左右，可基本满足肿瘤组织基因检测的要求，但在基因突变丰度如此低的液体活检样本面前却显得束手无策；ddPCR技术灵敏度可以达到0.1‰，可以用于低丰度基因突变检测，并已经成功应用于血浆EGFR检测。但ddPCR只能对已知突变位点进行检测，且不适用于融合基因。相比之下，NGS作为高通量的检测技术优势就显得非常明显；通过不断的优化，已经出现灵敏度达到万分之一的NGS检测试剂盒。而且NGS可以同时检测多种基因突变类型，包括体细胞突变、基因扩增和融合，可以对突变丰度低到0.02%的基因进行检测，且特意性达到96%，因此非常适合对液体活检进行基因检测。
2、开展大规模临床试验（如针对疾病早诊和监测）
不同于一般科学研究，任何临床技术和产品在进入临床应用前，必须经过相应的临床研究或试验来证明技术的安全性和产品的有效性。液体活检进入临床也必须通过这一途径。
3、科学研究的最终目标是通过技术革命来改善人们的生活
目前，学术界和工业界正在努力将液体活检的临床应用价值融入大众对健康和疾病的观念中，将液体活检的临床应用落实到与人们生活息息相关的实处。
与二代测序技术结合后，液体活检正在逐步成为分子诊断中不可或缺的一部分，并快速进入临床，渗透到产前诊断，肿瘤治疗，器官移植，心血管疾病和神经退行性疾病等多个领域。可以相信，随着二代测序等高通量，高灵敏度和高准确性的技术的快速发展，分子水平的“液体活检”必将在精准医疗临床应用中发挥越来越重要的作用。
参考文献：Cai X, Janku F, Zhan Q, Fan JB. Accessing genetic information with liquid biopsies. Trends Genet. 2015 Oct;31(10):564-75. doi: 10.1016/j.tig.2015.06.001.
本文来源于：测序中国
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