多基因同时敲除实现热纤维梭菌利用生物质高产乙醇

热纤维梭菌Clostridium thermocellum是一类嗜热、严格厌氧的革兰氏阳性菌，它具有降解纤维素和产乙醇的能力，在纤维小体和纤维素酶的作用下将纤维素生物质转化为乙醇。热纤维梭菌在生成乙醇的同时还伴随有机酸如甲酸、乙酸、乳酸和氢气的生成，为了达到乙醇产量的最大化，旁路途径必须删除。

之前已有研究通过减少一种或两种副产物生成来建立工程菌株，包括1）删除磷酸转乙酰酶基因(pta)以减少乙酸生成；2）删除乳酸脱氢酶基因(ldh)以减少乳酸生成；3）删除脱氢酶基因(hydG)以减少氢气的生成；4)删除甲酸合成裂解酶基因(pfl)以减少甲酸生产。但是这些工程菌仍产有机酸或者氢气，酸化了培养基，使碳原和电子流向了丁醇途径之外，降低了丁醇的生成。

最近，有研究者在一株热纤维梭菌中将脱氢酶基因(hydG)、甲酸合成裂解酶基因(pfl)、磷酸转乙酰酶基因(pta)-乙酸激酶(ack)和乳酸脱氢酶基因(ldh)同时敲除，获得5基因敲除菌株C. thermocellum Δhpt ΔhydG Δldh Δpfl Δpta-ack (又称为strain AG553)。在5g/L的可溶纤维二糖培养基上培养时，AG553生成乙醇滴定量为32.8mM，而野生型菌株乙醇滴定量为17.7mM；在氢气生成上，AG553菌株比野生型菌株减少约5倍。随后研究人员以洗净、酸稀释等预处理后的杨木和柳枝作为培养基来测试AG553菌株转化植物生物质的能力。

AG553菌株和野生型菌株在预处理后的杨木和柳枝上，经288小时完成发酵，AG553能生成24.9mM的乙醇，而野生型只生成13.0mM的乙醇。接下来，研究人员将 AG553放在不同浓度（1，5，10，20，30和50g/L）的纤维二糖培养基中培养，以实现AG553最佳滴定量的目的，发现AG553的最佳滴定量是在20/L的纤维二糖培养基培养能达到73.7mM的乙醇产量。

对于工业丁醇生产，利用低成本、可再生的底物是一个非常重要的环节，模式底物如纤维二糖可用于实验室研究以快速获得表型，但将模式底物上的表型衍生至生物质底物如杨木和柳枝非常重要。在该项研究中，AG553菌株在生物质底物和模式底物上有相似的表型，暗示了AG553菌株发酵不受真料液中的物质抑制，因此AG553菌株将可作为木质纤维素生物能源生产研究及优化木质纤维素生物能源生产过程的平台菌株。

李琦 摘自 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717615001056

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