那些年踩过的DNA测序大坑

DNA测序技术自从发明以来，作为一种重要的分子生物学手段，正在科研和临床上得到了越来越广泛的应用。毛博做测序不多，还是去米国以后才开始接触的。但是也踩过不少大坑。也有不少从坑里爬出来豁然开朗的时候。下面，毛博介绍一下自己亲自踩过的坑。也算给大家一个前车之鉴吧。

坑一：信号衰减/中断

测序信号衰减和中断，是测序过程中的常见问题，原因多种多样：模板中含有重复序列，模板中含有高级结构，模板中GC含量过高等，都会使得测序信号衰减和中断。另外，引物的质量不好，试剂失活了，都会造成这种问题。解决的方法：反其道而行之，采用反向引物来进行测序，然后通过序列拼接获得全长。有时候就象做拼图游戏。大家have fun吧。这里，毛博教大家一个小窍门：在这个过程中，可以适量地加入DMSO，并且进行扩增。

坑二：重叠峰/乱峰

这个问题一般是由于序列前面有连续的碱基，或者是引物的碱基缺失了。如下图所示，模板中有单一位点的碱基缺失，碱基缺失导致测序结果移码。

现在有很多测序公司，号称可以帮助设计引物；号称引物是PAGE级别的。这里，毛博严重不推荐哈。最好还是自己动手，丰衣足食。解决办法：自己设计引物；自己合成引物；自己将引物进行PAGE纯化。反正就是掌握一个原则：自己动手，丰衣足食。

坑三：Ploy结构

有的时候，我们会遇到Poly结构，就是G/C rich，G/C Cluster，Poly A，Poly T结构等。这种结构的测序容易出现移码现象，导致测序信号衰减和中断（如下图）。解决方法：还是反其道而行之。采用反向引物对模板进行测序，测到该poly结构处，进行拼接，不就可以获得序列全长嘛。

坑四：空载体

原因为：目的片段插入失败，或者培养过程中目的片段丢失。解决方案：重起炉灶。重新挑选单克隆，进行PCR后，再送去测序。

坑五：测序结果和文献资料不一样

这是个当初让我很纠结的问题。我当时一直以为是自己的实验哪里出问题了，或者是测序公司那里出问题了。后来终于弄清楚了：这个问题是没有办法滴。同一种动物，不同的种族，甚至不同的个体，基因序列都不一定完全一样。如果是PCR产物克隆测序，那还有PCR过程中的错配因素等等。

一般比较正规的测序公司，提供的测序结果都是忠实结果，和文献序列不一样，也就只好不一样啦。

坑六：重复序列

如下图所示，好看吧？好看是好看，但是你真的看到这个结果，可能就要哭鼻子了。可能的原因：样品中就含有重复序列，结果导致：测序结果和Poly A/T的结果一样。这也会导致Frame滑动，结果出现移码。

解决办法：还是反其道而行之，反向测序。有时能够顺利的通过重复序列区域，但是有时候又不一定能够。全靠运气吧。如果能够的话，通过多次的测序结果比对，还是做拼图游戏吧，拼接可以得到全序列结果。

作者：毛博/解螺旋

本文来源于：解螺旋

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