PNAS：升级基因组编辑技术帮助改造T细胞

在由加州大学旧金山分校的研究人员牵头的一个研究项目中，科学家们设计出了一种新策略利用基因组编辑系统CRISPR/Cas9来精确改造人类T细胞。由于这些免疫系统细胞在糖尿病、艾滋病到癌症等广泛疾病中都发挥着重要作用，这一研究成果为开展T细胞功能研究提供了一个万能的新工具，并为开发出基于CRISPR/Cas9的疗法来治疗许多严重的健康问题提供了一条途径。

利用他们的新方法，科学家们能够使得t细胞表面的CXCR4蛋白丧失功能——HIV利用了这一蛋白来感染T细胞引起艾滋病。研究小组还成功地关闭了PD-1——这一蛋白在新兴的癌症免疫治疗领域吸引了众多科学家的密切关注，研究证实采用一些药物来阻断PD-1可以诱导T细胞攻击肿瘤。

由于能够在几乎所有的生物体中简单、廉价地编辑遗传信息，CRISPR/Cas9系统让公众及科学家们均为之神往。T细胞随血液循环，能够很容易地从患者处采集到它们，用CRISPR/Cas9进行编辑，再输回患者体内发挥治疗效应，它们是实现CRISPR/Cas9技术医疗应用一个显而易见的候选者。

新研究的资深及共同通讯作者、加州大学旧金山分校Alexander Marson博士说，但实际上，采用CRISPR/Cas9编辑T细胞基因组被证明相当的困难。“在人类T细胞中进行基因组编辑是该领域一个显著的挑战。因此，我们花了一年半的时间来设法在功能性T细胞中优化编辑。由于有着许多潜在的治疗用途，我们希望确保能够尽我们最大的努力来推动这些应用。”

新研究工作是由加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna博士和加州大学旧金山分校细胞与分子药理学教授Jonathan Weissman博士共同主导的一项联合项目“基因组学创新计划”(Innovative Genomics Initiative)的支持下完成的。Doudna是CRISPR技术的共同开发者，曾因这一技术获得了“生命科学突破奖”(Breakthrough Prize)，是CRISPR专利的有力竞争者。

Doudna说，这项研究是朝着将CRISPR/Cas9编辑能力带到人类生物学和医学中迈出的重要一步。

Cas9是CRISPR系统中完成DNA切割及插入新遗传序列的一种酶。研究人员通常是采用病毒或是质粒将其导入到细胞中。然后在一个单独的步骤中，将引导Cas9去到DNA中特异切割位点的单向导RNA也置于细胞中。

然而直到最近，采用CRISPR/Cas9来编辑人类T细胞仍然效率低下，只有相对很小比例的细胞成功获得改造。尽管研究人员通过插入或删除随机序列在关闭基因方面取得了一些成功，但他们一直无法利用CRISPR/Cas9敲入特异新序列来纠正T细胞中的突变。

7月27日的PNAS上，由共同第一作者、Marson实验室博士后研究人员Kathrin Schumann，和Doudna实验室的博士后研究人员Steven Lin领导的一个研究小组，通过简化将Cas9和单向导RNA到细胞中去的过程解决了这些问题。

在实验室培养皿中，研究小组让Cas9蛋白与单向导RNA结合，组装出了Cas9核糖核蛋白(RNPs)。随后他们利用电穿孔方法快速将这些RNPs传送到细胞内部。

通过这些创新，研究人员成功地编辑了CXCR4和PD-1，甚至敲入新序列替换了这些蛋白质中的一些特异遗传“字母”。研究小组随后利用细胞表面表达的一些标记物分选了这些细胞，帮助提取出了可用于研究，并最终用于治疗用途的成功编辑的细胞。

Schumann说：“长期以来，我们一直在设法用质粒或慢病毒导入Cas9，然后在细胞中分别表达单向导RNA。利用细胞外生成的RNPs，使得细胞负责这一过程尽可能少的部分，便产生了很大的不同。”

Marson强调，尽管近期采用CRISPR/Cas9编辑人类胚胎的研究报道引发了极大的争议，T细胞是在每个个体中重新生成，因此遗传改造不会传递给下一代。他希望一些基于Cas9的疗法将能够在未来进入到临床中治疗T细胞相关疾病，包括一些自身免疫疾病及诸如“气泡男孩症”等免疫缺陷。

原文索引：

Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins

T-cell genome engineering holds great promise for cell-based therapies for cancer, HIV, primary immune deficiencies, and autoimmune diseases, but genetic manipulation of human T cells has been challenging. Improved tools are needed to efficiently “knock out” genes and “knock in” targeted genome modifications to modulate T-cell function and correct disease-associated mutations. CRISPR/Cas9 technology is facilitating genome engineering in many cell types, but in human T cells its efficiency has been limited and it has not yet proven useful for targeted nucleotide replacements. Here we report efficient genome engineering in human CD4+ T cells using Cas9:single-guide RNA ribonucleoproteins (Cas9 RNPs). Cas9 RNPs allowed ablation of CXCR4, a coreceptor for HIV entry. Cas9 RNP electroporation caused up to ∼40% of cells to lose high-level cell-surface expression of CXCR4, and edited cells could be enriched by sorting based on low CXCR4 expression. Importantly, Cas9 RNPs paired with homology-directed repair template oligonucleotides generated a high frequency of targeted genome modifications in primary T cells. Targeted nucleotide replacement was achieved in CXCR4 and PD-1 (PDCD1), a regulator of T-cell exhaustion that is a validated target for tumor immunotherapy. Deep sequencing of a target site confirmed that Cas9 RNPs generated knock-in genome modifications with up to ∼20% efficiency, which accounted for up to approximately one-third of total editing events. These results establish Cas9 RNP technology for diverse experimental and therapeutic genome engineering applications in primary human T cells.

作者：阳光森林