Genome Biology：单细胞转录组测序法

摘要 : 2015年七月二十三日，北京大学生物动态光学成像中心的黄岩谊、汤富酬课题组在国际著名学术杂志《Genome Biology》发表一项最新研究。该研究开发出一种单细胞通用的、poly(A)-独立的RNA测序（SUPeR-seq）方法，来测定单个细胞的多腺苷酸RNA和非多腺苷酸RNA。这种方法表现出稳健的敏感性和准确性，为解析哺乳动物早期胚胎发育过程中circRNAs的功能意义和调控机制，奠定了基础。

北京大学生物动态光学成像中心(Biodynamic Optical Imaging Center, BIOPIC)是北京大学于2010年成立的一个跨学科合作实体研究中心。中心的目标是发展和利用最先进的生物成像与基因测序手段，在分子和细胞水平上进行生命科学与医学基础研究。中心配备了界一流的研究设备和条件，有重点地发展最新的生物成像和测序技术。

2015年七月二十三日，该中心的黄岩谊、汤富酬课题组在国际著名学术杂志《Genome Biology》发表题为“Single-cell rna-seq transcriptome analysis of linear and circular RNAs in mouse preimplantation embryos”的论文。该研究开发出一种单细胞通用的、poly(A)-独立的RNA测序(SUPeR-seq)方法，来测定单个细胞的多腺苷酸RNA和非多腺苷酸RNA。这种方法表现出稳健的敏感性和准确性。这项研究工作，为解析哺乳动物早期胚胎发育过程中circRNAs的功能意义和调控机制，奠定了基础。延伸阅读：山大泰山学者发布新的转录组组装方法。

转录组包括一个细胞内转录的全部RNA。即使在同一类型的细胞中，不同个体细胞的转录组之间存在着内在的异质性。为了充分揭示这种复杂性，就需要对单个细胞进行理想的转录组分析，并覆盖每一个细胞内所有的RNA。

在2009年，该课题组首先开发了一种单细胞RNA转录组分析技术(‘Tang2009’ 程序)，自那以后，各种各样的单细胞RNA-seq方法也相继开发出来，如Smart-seq、CEL-Seq和Quartz-Seq。这些方法已经迅速成为解析单细胞转录组复杂性的有力工具，特别是在胚胎和神经发育、细胞重编程和癌症进展研究中。

所有已知的真核细胞单细胞RNA-seq程序，仅限于检测具有poly(A)尾巴的mRNA(poly(A)+ RNAs)。然而，有大量的非多聚腺苷酸RNA(poly(A)- RNA)在哺乳动物细胞中表达。标准的方法依赖于oligo(dT)来启动逆转录(RT)。通过Oligo(dT)启动，可避免无信息核糖体RNA(rRNA)测序读长的优势，否则它们占哺乳动物细胞总RNA的90%。然而，这种方法不可避免地会排除其他没有poly(A)尾巴的RNA的信息。

特别是，最近有研究在真核细胞中发现了一套独特的poly(A)- RNAs——环形RNA(circRNAs)。这些circRNAs多数是由编码基因的外显子组成，而一些研究也报道过内含子circRNAs。circRNAs往往与重要的细胞功能有关，如结合并抑制micrornA(miRNA)作为一个海绵。目前，很有必要开发一种方法，来检测单细胞内完整的转录组，包括poly(A)+和poly(A)- RNAs。

在这项研究中，研究人员开发出一种新型的单细胞转录组分析方法，命名为单细胞通用poly(A)-独立的RNA测序(SUPeR-seq)，这种方法用具有锚序列的随机引物，取代常用的oligo(dT)引物，用于cDNA合成。SUPeR-seq能够检测到单细胞内的poly(A)+和poly(A)- RNAs，具有来自rRNAs的最小污染。

与Tang2009程序相比，该方法具有更高的灵敏度，能检测更多的基因。来自基因组DNA和rRNA的污染是可以忽略不计的。使用SUPeR-seq，该研究小组总共发现了来自HEK293T 细胞的141 个circRNA转录本和来自单个小鼠早期胚胎的2891个circRNA转录本。

此外，该研究小组通过对从单个小鼠植入前胚胎产生的SUPeR-seq读长进行从头组装，发现了几百个新的非圆形转录本。通过将来自小鼠卵母细胞的SUPeR-seq 读长与来自2-细胞阶段胚胎的SUPeR-seq读长进行比较，研究人员确定了两个母系和合子基因;通过对用α鹅膏蕈碱(基因转录的强效抑制剂)处理的2-细胞胚胎进行测序，81%的合子基因得以进一步的验证。因此，这些结果指出了SUPeR-seq的高度稳健性和潜在效用。

原文标题：Single-cell RNA-seq transcriptome analysis of linear and circular RNAs in mouse preimplantation embryos

原文摘要：Abstract：Circular RNAs (circRNAs) are a new class of non-polyadenylated non-coding RNAs that may play important roles in many biological processes. Here we develop a single-cell universal poly(A)-independent RNA sequencing (SUPeR-seq) method to sequence both polyadenylated and non-polyadenylated RNAs from individual cells. This method exhibits robust sensitivity, precision and accuracy. We discover 2891 circRNAs and 913 novel linear transcripts in mouse preimplantation embryos and further analyze the abundance of circRNAs along development, the function of enriched genes, and sequence features of circRNAs. Our work is key to deciphering regulation mechanisms of circRNAs during mammalian early embryonic development.

作者：秩名

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