Science：微生物学说推动着生命科学技术发展
19世纪，有人提出：疾病真正来源于那些肉眼看不到的生物体，而不是人们所认为的废气和恶劣的卫生条件。先驱研究者因这个想法而开发了无菌培养技术，改良了显微观察能力，并且创造了一系列尖端的工具。到了21世纪，有些生物学家开始支持一个更荒谬的理论：人类和其他大型生物并不是人们所认为的个体存在，而是依赖于数百万微生物之上完整的生态系统。提出这一奇特观点的先驱研究者发展了新的取样策略、强大的基因测序和数据分析新技术以及其他革命性的技术。以上两个理论都能够被当时的科学家渐渐相信它们是正确的。相关文章发表于2013年5月10日的《science》杂志上。
Science：微生物学说推动着生命科学技术发展
“我们所拥有的微生物基因组多于我们身上的人类细胞。我们是一个行进中的生态系统。这是一个意义相当深远的现实。”加利福尼亚州卡尔斯巴德市Life Technologies公司研发部主管Timothy Harkins说。
无法培养的大多数
微生物学家早就知道，很多细菌、真菌、原生生物和病毒无法利用现有的培养技术在实验室中生长。但是，当前随着下一代dna测序技术价格暴跌、敏感性飙升，研究者终于可以研究这些无法培养的大多数。
这一新兴领域的大多数研究都涉及环境取样，对样品进行最大限度的DNA测序，使用序列信息鉴定其中的物种并分析其生态学功能。实验结果有时出乎意料。比方说，对人类肠道的微生物组分析揭示，每个人的大肠都携有一套独特的细菌物种混合体，而这一肠道生态系统的扰动会带来严重的健康问题甚至饥饿感。
尽管DNA测序搭建了微生物组的基础，但如果脱离了细致的取样和实验设计，再好的测序流程也只是白费力。加利福尼亚州戴维斯市加州大学进化和生态学教授Jonathan Eisen表示：“测序很令人兴奋，也很有趣，人们经常……比如说，‘先把所有东西都测了，之后再去整理’。” Eisen坚称，这一想法粉饰了一些重要问题：“你是要活的细胞吗?还需要死的细胞吗?‘我打算分析DNA’这种说法太粗枝大叶了。”
除了加入死细胞和宿主DNA等干扰因子之外，粗糙的取样可能会破坏研究者最初想找的基因组。“当一个(厌氧的)细菌暴露在有氧环境中，将会出现细胞凋亡，杀死自己，破坏它的基因组。那么，你如何来鉴定这种情况?”Harkins问道。
研究者一旦决定了如何收集有用的样品，就需要明确好问题，以及如何为答案搭建框架。幸运的是，动物学家和植物学家在数十年间一直在寻找鉴定生态系统的研究路径。但不幸的是，他们尚未达成一致。
为了对生物体进行归类，生物学家既可以采用分类学方法列出现存物种，并按照其特征和所占据的生态位进行分类，也可以基于进化关系构建系统发育树。但人们对这两种方法都褒贬不一。“人们已经为此争论了一百年。”Eisen本人则站在系统发育一边。
从某种程度上说，对生态系统的多样性进行定量会更加直接。生态学家通常检测3种形式的多样性：α多样性，基于一个特定区域中物种或系统发育组的数目;β多样性，比较不同区域的多样性;以及γ多样性，使用α和β多样性解释一个大的生态系统中的总体生物多样性。在医学微生物组中，研究者经常在个体的微生物样本中检测α多样性，而在不同个体的微生物组间计算β多样性。
碱基覆盖
在选定一种实验设计之后，微生物组的研究人员进入测序阶段，这时他们会面临另一个重要选择：是测核糖体RNA(rRNA)还是测全基因组的随机片段。
在rRNA测序中，研究者使用专门设计的引物，仅用于扩增16S核糖体RNA的基因，这一分子在进化过程中变化极其缓慢。样品中不同rRNA序列的数目很好地代表了物种的数目，这类序列的公共数据库也可用于鉴定许多物种。相比较而言，鸟枪法或宏基因组测序是在一个样品中检测全部基因组的短小、随机片段，然后试图将其拼接在一起。
两种方法各有利弊。康涅狄格州布兰福德市罗氏公司454 Life Sciences公司研发部负责人Todd Arnold说：“有些人喜欢用鸟枪法，我认为因为总的来说它可以很简单，(但是)核糖体RNA在富集技术方面(确实有效)。”核糖体RNA测序对人类微生物组的样品特别有用，因为该技术能够相对容易地忽略大量宿主DNA的背景，而仅仅聚焦在微生物组成上。该领域的研究者也把rRNA测序当作更成熟的技术，因为它具有更加明确的程序和清晰的仪器选择。
然而，宏基因组测序可以鉴定出整个基因组范围内更广泛的变异，而且最终有望使科学家在混合样品中测出全基因组。“我认为宏基因组分析的一些方面正在更加常规化，现成可以使用。此外，我们还可以从宏基因组数据中获得更多信息。”加利福尼亚州斯坦福市斯坦福大学微生物与免疫学教授David Relman指出。
幸运的是，测序仪器制造商并没有吃老本，几家公司正在竞相提高仪器在两方面的性能。尽管许多微生物组研究人员近期已选定Illumina的HiSeq系统来进行rRNA的课题，Eisen很快指出测序技术仍然在快速变化。“我不认为它已经达到了平台期。”他还表示，特别是宏基因组研究的基因组测序正在孕育新突破。
不管生物学家选择哪个平台，他们都想要更加用户友好的技术。“测序技术已经不再是精通测序人员的专利，也不仅限于核心实验室。” Arnold说。当代的高通量测序仪都是高度自动化，其软件能够分析原始数据，进行初步质量控制检验。
当早期的几个微生物测序应用进入到严格管理的医药研发界，一些工具制造商已将自动化的发展推进了一大步。例如，Applied Biosystems公司的Microseq平台能进行常规的Sanger法测序，鉴定制药设备中的细菌和真菌污染。该系统简化了测序流程，可以快速准确地检测某些特定生物体，不再探究整个微生物组中的所有物种组成。
深挖数据
然而，基础研究者无法从微生物组样品中得到流程化的数据和简单的答案。加利福尼亚州圣地亚哥市Illumina公司微生物部高级市场经理Susan Knowles说：“(微生物组)研究涉及到深度测序，在数据存储和数据分析方面都是数据密集型。”
这一领域仍处于早期阶段，大多数分析这些数据的软件都来自于研究者本身。Knowles也说，“(微生物组学的)研究者使用一系列的开源工具，这些数据分析工具大多需要生物信息学技能。”
对于刚刚接触高通量测序的研究者而言，一台测序仪所产生的信息绝对量能吓到他们。454公司Arnold举例说，海量的数据经常让新手手忙脚乱。
在聚焦rRNA的研究中，研究者可以利用可能序列的简化数据池和已知rRNA基因的大数据库。由于这项技术比鸟枪法微生物组测序更加成熟，rRNA的分析软件也比较容易。当然，这取决于实验者想要寻找什么信息，简单的rRNA项目可能不需要雇佣(或成为)生物信息学人员。
鸟枪法测序则完全不同。“宏基因组相关的方法则更加复杂。” Eisen说。
在宏基因组研究中，研究人员不得不从支离破碎的序列中鉴定出可能的基因，分析这些基因属于什么基因家族，另外还要鉴定出它们来源于什么物种。每一个步骤都面临着独特而严峻的挑战。
微生物组数据分析也引发了生物学家几个世纪以来的争论：到底什么是物种?植物学家和动物学家已经试探性地给出了定义，然而在细菌中，混杂的基因交换和快速的进化让整个概念变得微妙。对于病毒而言，这些概念甚至可能无法应用。更糟的是，微生物组学自身也可能会破坏物种区分的传统观点。如果每个生物体中的微生物生态系统都是保持其生命的关键，那么哪里是每个个体的终点和下一个起点?
为了避免陷入类似哲学的问题，许多微生物组研究者开始采用可操作性分类单元(operational taxonomic units，OTUs)的概念，这个实用的概念基于基因序列，类似于物种概念的表述，将高于给定阈值的序列归入不同的OTUs。
由欧盟资助的MetaHIT计划最近开始使用另一种方式：基于样品中不同基因家族的潜在功能来鉴定人类肠道微生物组，而不是通过携带这些基因的物种。Eisen解释说：“他们是最早一批进行功能β多样性和α多样性的科学家。”就像生物学家处理分类学。这样看来，最重要的是生物体对生态系统的贡献，而不是它们的身份或进化起源。
在研究者决定如何看待一个生态系统后，他们需要解释数据中的固有偏好。“不存在没有偏好性的手段。真正的挑战和主要的目标在于理解偏好是如何在数据中产生的，怎样才能最小化或控制住这些偏好。” Relman说。例如，将样品暴露在氧气中可以去除厌氧性生物，对DNA测序可以回避包括RNA的病毒，温和的提取方法可能无法裂解坚固的真菌或细菌芽胞。
目标长远
当微生物组学的先行者继续探寻最好的方式来提出科学问题时，工程师和仪器制造商正在尝试解决一些遗留的技术需求。
日程表上第一项就是更长的序列读取。Harkin补充说：“读取越长越好，300个碱基似乎是个最佳点，300到350。而下一个最佳点是大约600、800个碱基对。”这些长度可以使研究者在不同的分辨率水平上绘制微生物多样性图谱，而长度越长，物种间区分也更加细致。
研究者可以通过更长的rRNA序列读取，更清晰地分辨系统发育树或分类列表中的物种，而更长的宏基因组读取则让研究者可以更方便地组装每个生物体基因组的大片段。这些公司也在试图让它们的测序系统在处理多重样品方面更加高效，这对于试图鉴定人类群体间微生物组差异的大规模临床研究而言尤为重要。
科学家正在尝试定义清晰的方法和控制，以保证结果可重复。这也是一个棘手的问题。“人们并没有检测使用过的大量方法，他们直接按一下按钮，运行它们，而我们也在做着相同的事。”Eisen说。高度自动化的测序系统很容易产生数据，但是如果缺少数据分析的清晰脉络，就无法清楚地理解这些结果意味着什么。为了试着建立一个参考点，最近，Eisen和他的同事把自然界中绝不会相遇的已知细菌物种混合起来，打造了一个完全人为制造的微生物组。“我们用不同的方法对它们进行鸟枪法测序，然后我们开始检测，在我们已经知道答案的系统中，我们可以在多大程度上真正了解这个系统。即使在这个相对简单的人工系统中，有些部分也非常有难度。”他说。
经典的微生物学可能会有所帮助。Relman提到，新的测序技术再加上在鉴定微生物环境方面对细节的努力，可以帮助研究者确定早先无法培养生物的培养要求。只有可以在实验室中培养这些微生物，才能更好地对其进行研究。
更多探索性的微生物组调查也能够明晰该领域的一些界限，特别是在医学研究领域。例如，一项正在进行的肺微生物组课题已经鉴定出健康个体肺中广泛的微生物群体变异。“健康的微生物组是什么?我们仍然不知道，我们仅仅是抓到了表面。”Harkin说道。
同时，微生物组测序和数据分析也越来越简单、便宜，因此即使是本科生和普通市民现在也能像研究动物群一样研究微型动物群。“你会惊讶，有多少人才刚刚开始在核糖体RNA中做这些。这多少区别于拿一套望远镜和鸟类指南，但是他们已经掌握了这项技术。”Eisen说。
原文检索：
Microbiomics:The Germ Theory of Everything. Science,Alan Dove. Science, 10 May 2013; DOI: 10.1126/science.opms.p1300075
