用CRISPR实现斑马鱼高效基因敲入

近期，来自中国科学院上海生命科学研究院、上海科技大学等处的研究人员报道称，他们利用CRISPR/Cas9系统开发出了一种内含子为基础的基因组编辑方法，实现高效的斑马鱼基因敲入(knockin)。这一重要成果发表在六月十九日的国际肿瘤权威期刊《Oncotarget》。

中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所的杜久林(Jiu-lin Du)研究员是这篇论文的通讯作者。其1993年毕业于中国科技大学，1998年在中科院上海生理研究所获博士学位，中科院百人计划入选者，主要研究方向是感觉整合与学习记忆行为产生的分子、突触和神经回路机制，以及血管发育和功能的神经调节。

敲入动物是生物学研究的多功能工具。例如，为了了解致死基因在胚胎后期功能中的作用，研究人员通常使用敲入动物——在感兴趣的基因组位点携带loxP插入，产生条件性基因敲除动物。敲入介导的特异性细胞荧光蛋白标记或内源性蛋白，为在体内跟踪这些细胞或蛋白质动态，提供了一种强有力的方法。

斑马鱼是生命科学研究中一种新兴的脊椎动物模型。虽然锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应核酸酶(TALENs)或CRISPR/Cas9系统介导的斑马鱼功能缺失基因组编辑，已经陆续开发出来，但是基因敲入方法仍然处于起步阶段。目前还缺乏可行的方法，将一大段DNA序列插入特定的基因组位点，成为斑马鱼相关研究的一个瓶颈。

在今年四月份，该研究小组在《Cell Research》报道了一种新的基因敲入方法。在这项新的研究中，他们利用同源指导修复(HDR)介导的小鼠基因敲入和NHEJ(同源末端连接)介导的细胞培养物供体基因整合，开发出一种CRISPR/Cas9介导的、高效的斑马鱼基因敲入策略，可以广泛应用于标记不同的细胞类型，以及标记内源性蛋白。采用这种策略，研究人员特异性地标记了多巴胺能神经元、血清素激活的神经元、胶质神经细胞和内皮细胞。研究人员还成功地在内源性胶质纤维酸性蛋白的羧基端加入了一个EGFP标签。

在这个基因敲入系统中，研究人员从靶基因的一个内含子挑出一个sgRNA靶标，跨越sgRNA靶位点到靶基因的3’基因间隔区的一段DNA序列，加入到供体质粒中，作为同源臂。因为这一策略保留了完整的阅读框和靶向内源基因的5’和3’调控元件，所以保持了靶基因的完整性。

此外，sgRNA靶标的内含子设计，可以避免NHEJ引起的外显子中的不精确整合，所有插入事件都是框内的，因此与外显子为基础的方法相比，这种方法可带来高三倍的敲入效率。在供体质粒中加入右臂——靶基因的3’基因间隔区，是至关重要的。根据这项研究表明，对于供体的制备来说，质粒臂的长度并不重要，只要臂序列满足几点要求：1)sgRNA必须包含在左臂的内含子部分;2) 包含mRNA全部3’UTR序列的 3’基因间隔区必须包含在右臂。

保证成功基因敲入的另一个关键点是，sgRNA的裂解效率。几个sgRNAs可以被设计成靶定左臂的内含子序列，应该挑选具有最高切割效率的sgRNA，进行敲入实验。

原文标题：Intron-based genomic editing: a highly efficient method for generating knockin zebrafish

原文摘要：Abstract: The TALEN and CRISPR/Cas9 nuclease systems have been extensively utilized in genomic engineering of model organisms. In zebrafish, the nuclease systems have been successfully applied in generating loss-of–function knockout lines. However, genome-specific knockin techniques in zebrafish are still at the beginning. In this perspective, we briefly summarize the recent progresses on knockin approaches in zebrafish with a special focus on the newly developed intron-based knockin method.

作者：秩名