CRISPR/Cas9技术在转基因动物中

作者李佳鑫、冯炜，、王志钢、王彦凤单位系内蒙古大学生命科学学院

摘要：CRISPR/Cas9技术是一种新型的基因组定点编辑技术，具有设计简单、特异性强、效率高及可以在目标位点产生多种类型的编辑结果等特点，适用于在多种细胞中进行大规模的基因编辑。综述了CRISPR/Cas9技术的研究背景、基本原理和研究进展，从靶基因敲除(knock-out)、外源基因整合(knock-in)和目标基因转录沉默(knock-down)等方面总结了CRISPR/Cas9在转基因动物中的应用概况，并对现有的三种基因组定点编辑技术进行了比较。CRISPR/Cas9技术在转基因动物中具有明显的应用优势和良好前景。

随着对CRISPR/Cas9系统的研究深入，该技术现已广泛地应用于生物领域的各个方面，在动物基因功能和转基因动物研究中包括了knock-out特定基因、定点knock-in目的基因和knock-down靶基因等方面，为转基因动物研究提供了简易、实用的基因组定点编辑技术。

1 在基因敲除中的应用
CRISPR/Cas9技术由两个基本的成分组成，sgRNA和Cas9蛋白，sgRNA用于识别靶基因，Cas9蛋白用于诱发DSBs（双链断裂损伤）。当修复模板序列不存在时，基因组将启动NHEJ（非同源末端连接）修复途径，由于这种修复途径中往往会引入插入/缺失突变，导致DSB位点下游序列发生移码突变或无义突变，从而破坏开放阅读框，直接导致目标基因功能的减弱或者完全丧失。但是需要特别指出的是，这些由NHEJ修复途径所造成的突变种类是随机的，所以需要通过进一步的实验验证。

利用CRISPR/Cas9技术构建靶基因konck-out细胞系，首先需要明确靶基因的功能及表达情况，其次需要确定该细胞系单克隆生长情况及生长条件，最后需要对靶基因进行同源序列分析。一般选择在单克隆细胞生长状况良好的细胞系中对同原序列较少且表达状况良好的基因进行突变。sgRNA序列的设计则首先要明确靶基因的编码序列(CDS)区域，分析相应的基因组结构，明确其外显子区域并在外显子区域上确定待敲除位点。为了最大化地破坏基因的生理功能，一般待敲除位点尽可能选择靠近起始密码子的位置。确定待敲除位点后，可以通过在线的sgRNA设计软件设计sgRNA。常用的sgRNA设计软件包括麻省理工学院的CRISPR Design(http：//crispr.mit.edu/)和德国癌症研究中心的E-Crisp(http;//www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)。根据设计好的sgRNA序列构建与Cas9蛋白共表达的表达载体，转染靶细胞，利用有限稀释法筛选单克隆，验证基因突变。

近期，中国学者利用CRISPR/Cas9技术成功构建了TYR等位基因突变的猪胎儿成纤维细胞系和PARK2和PINK1双基因knock-out的细胞系，并且利用体细胞核移植技术(SNCT)成功培育出基因突变的猪个体，证实了CRISPR/Cas9技术引入的基因修饰可以通过生殖细胞稳定传递到下一代。同时，韩国学者利用该技术在牛的eGFP转基因体细胞系中成功地实现了对eGFP基因的敲除，敲除效率超过40%。在食蟹猴的单细胞胚胎中注射Cas9 mRNA和sgRNA，同时损坏了Ppar-γ和Rag1两个基因的结构和表达，并且没有脱靶现象发生。这些研究成果说明利用CRISPR/Cas9技术对大型动物进行基因组定点编辑是高效、可靠的，并且可以产生特定基因修饰的个体。

2 在基因定点整合中的应用
利用CRISPR/Cas9技术在基因组的目标位点产生DSBs后，当修复模板存在的情况下，细胞会激活另外一种DNA损伤修复途径即基因同源重组修复途径(HDR途径)。这种途径会严格按照修复模板来修复断裂的DNA双链，可以在目标基因的突变位点产生精确的特定突变，常用来在基因组目标位点引入外源基因。该途径用于基因组定点编辑的效率比利用NHEJ途径进行基因敲除的效率低，根据细胞类型和状态以及基因位点和修复模板的不同，引入外源基因的效率也有所差别。利用 HDR修复途径对DSB进行修复，修复模板必须与DSB位点上下游的序列高度同源，为此在目标位点引入外源基因时通常需要在外源基因的上下游分别设计一段与DSB位点上下游序列高度同源的同源臂序列。

修复模板既可以是传统的构建在载体质粒上的双链DNA序列也可以是单链的寡聚核苷酸序列(single-strand DNA oligo nucleotides，ssODNs)。对于小片段(＜50bp)的外源基因的靶向整合，一般会利用ssODNs 作为修复模板，它的同源臂的长度一般在50～80 bp之间，而且它的整合效率要比质粒作为供体模板进行基因整合的效率高。对于大片段(＞100 bp)的外源基因的靶向整合，一般会利用供体质粒(donor plasmid)作为修复模板，它的同源臂的长度一般在800 bp左右。利用HDR修复途径在目标基因的靶位点造成的基因插入突变同样需要利用实验去验证。

利用CRISPR/Cas9技术构建knock-in细胞系其操作流程与构建knock-out细胞系的操作流程基本相同，区别是需要构建一个引入外源基因的修复模板。将设计好的sgRNA和Cas9蛋白的表达载体与修复模板共转染靶细胞，利用有限稀释法筛选单克隆，测序验证基因整合。最近，韩国学者和中国学者合作利用CRISPR/Cas9技术成功地对牛的诱导多功能干细胞(IPSCs)基因组进行了基因定点编辑。他们选择NANOG基因座作为靶向修饰的位点，通过在IPSCs细胞中转染特异于NANOG基因的sgRNA和Cas9蛋白的共表达载体对NANOG基因进行修饰。他们设计了一个可以表达外源基因的供体质粒EFla-eGFP-IRES-Puro，将该质粒与sgRNA/Cas9蛋白的表达载体共转染牛IPSCs细胞，测序验证表明CRISPR/Cas9人工核酸内切酶诱发基因组同源重组，成功地将外源基因整合到NANOG位点并得到表达。进一步研究表明通过显微注射的方法在受精卵中导入NANOG-targeting sgRNAs/Cas9 和供体质粒，GFP基因可以在囊胚中得到表达。这一结果显示出CRISPR/Cas9技术可以在牛的基因组中进行高效特异的基因编辑，为培育转基因家畜提供了有效手段。日本学者利用同样的方法对斑马鱼的基因进行了基因组定点编辑，他们选择evx2基因位点和eng1b基因位点作为靶向修饰的位点。通过将表达外源基因的供体质粒与sgRNA，Cas9 mRNA同时显微注射到斑马鱼的胚胎中，成功地将外源基因整合到目标位点并得到表达。美国学者利用CRISPR/Cas9技术在鼠的胚胎干细胞中进行了外源基因的靶向整合，将外源FLAG-BIO标记抗原和外源GFP基因分别靶向整合到鼠的基因组中的mef2c位点的C端和Oct4位点，发现同源臂的长度与外源基因靶向整合效率有关。

3 在基因转录调控中的应用
对于特定基因的表达调控是研究基因功能的重要工具，自然产生或者人工合成的某些特异性的DNA结合蛋白可以通过与转录调控因子结合来改变目标基因的表达。 当Cas9的两个核酸结构域同时失活，这样的Cas9蛋白称之为dCas9蛋白，它不具有对DNA链进行切割的活性，但依旧具有基于sgRNA特异性与靶位点进行结合的能力。dCas9蛋白可以作为一个可编辑的DNA结合蛋白在sgRNA的诱导下通过与目标基因的功能区域结合，调控该基因的转录过程。dCas9系统调控目标基因转录在不同物种中发挥作用的方式也不相同。在原核细胞中，dCas9蛋白基于sgRNA的特异性与基因组中的编码区域结合并阻碍RNA聚合酶的结合与延伸，能够有效抑制目标基因的转录。但是在真核生物体内，利用这种方式调控目标基因转录的效果并不理想。在真核生物体内，转录调控机制相对复杂，基因的表达调控通常是多个转录调控因子的共同作用实现的。所以在真核细胞中，需要建立一个转录调控影响因子与dCas9蛋白融合表达的机制。通过将dCas9蛋白与转录抑制影响因子与转录激活影响因子在体内融合表达，可以高效特异地对目标基因的转录进行调控，也可以通过dCas9技术构建knock-down细胞系来确定目标基因转录的调控区域。Gilbert等在含有GFP基因的293T细胞中同时转染dCas9蛋白和转录调控因子的共表达载体和特异于GFP基因的sgRNA的表达载体。随后的研究表明，KRAB转录抑制子与dCas9蛋白融合表达可以高效抑制目标基因的转录，VP64转录激活子与dCas9蛋白融合表达可以高效增强目标基因的转录。在这种调控方式中，由于转录调控因子是与dCas9蛋白融合表达来调控目标基因的转录，所以对于基因组多个基因的同时转录调控因其调控方向的单一性，限制了CRISPRi系统的大规模应用。为了解决这一问题，近期又发展了相关技术，美国学者将靶位点的特异性识别和转录调控功能综合到一个分子中，通过将CRISPR sgRNA序列和能够招募RNA结合蛋白(该蛋白可以作为转录调控因子)的RNA序列结合起来，形成一个能够同时具有特异性识别目标位点和转录调控功能的RNA分子，称之为支架RNA(scRNA)。实验证明将sgRNA与MS2发卡结构结合能够在人的细胞中招募转录激活因子来调控基因的表达。利用这种方式可以实现同时在基因组的多个基因位点进行不同方向的转录调控，进而调控生物体的代谢途径，展示出CRISPR/Cas9技术在基因功能研究领域的应用前景。

CRISPR/Cas9技术相对其他基因编辑技术的应用优势
在CRISPR/Cas9系统出现之前，ZFNs人工核酸酶与TALEN人工核酸酶是另外两种用于基因定点编辑的技术，CRISPR/Cas9系统与这两种技术相比有明显的技术优势，包括更加容易设计sgRNA、构建与Cas9共表达的表达载体、较高的打靶效率以及在靶位点形成多种突变，更加适用于在多种细胞中进行大规模基因编辑。

在实验设计方面，CRISPR/Cas9系统具有简易性特点，只要根据靶基因序列需要设计一对寡核苷酸(oligo)序列用来编码特异的sgRNA，与Cas9基因蛋白的表达载体连接，几乎可以在基因组的任意位点实现基因定点突变；在对DNA双链进行切割方式方面，野生型的CRISPR/Cas9系统的Cas9蛋白已经证明可以在靶序列的第17个碱基对和第18个碱基对之间(PAM序列5′端的第三个碱基对)进行DNA双链的切割，切割位点十分保守；在基因定点突变的效率方面，CRISPR/Cas9系统与以前的人工核酸酶技术相比具有高效率诱导突变的特点，这一特点在不同物种和细胞都得到了体现。同时，利用CRISPR/Cas9系统还可以实现在同一基因组的多个基因位点进行突变和编辑，这极大地提高了基因突变的效率也缩短了整个突变型细胞系构建的时间。

CRISPR/Cas9的脱靶效应及改进措施的研究
同其他核酸内切酶类似，Cas9也会在目标位点外的其他位点即脱靶位点(off-target)对DNA双链进行切割，产生脱靶效应。由于sgRNA与基因结合时会允许3个以下的碱基的错配，而且sgRNA对靶位点的识别主要是通过14 bp序列(PAM序列及其3′端的11 bp)配对实现，这个长度的序列会在基因组中有较多的相似序列，是造成脱靶现象出现的主要原因。同时脱靶效应还受到多种因素的影响，如Cas9蛋白的浓度以及靶位点序列在基因组中相似序列的数量等。利用CRISPR/Cas9技术对靶基因进行定点编辑，如何去降低脱靶作用是一个必须事先考虑的问题。

在转基因动物细胞系中利用CRISPR/Cas9技术进行基因定点编辑，一般通过两步去降低脱靶作用。首先可以利用一些在线的CRISPR/Cas9 设计软件对sgRNA进行分析，确定其脱靶位点出现的可能性，选取脱靶位点最少的序列作为靶位点进行基因定点编辑；其次是利用滴定的方式转染Cas9和sgRNA的表达质粒，脱靶作用与转染的Cas9质粒的量密切相关，可以通过滴定的方式来保证转染效率的同时降低脱靶作用。2013年zhang等建立的“双缺口CRISPR/Cas9技术”为进一步降低脱靶作用提供了有效的解决办法。这一技术通过突变使得Cas9蛋白的两个核酸结构域RuvC和HNH中的一个失活，可以将野生型的Cas9蛋白转变为只能在DNA双链中的一条链进行切割并形成缺口的缺口酶(Cas9n)，同时在靶位点的上下游互补序列上设计一对相邻且位于不同DNA链上的sgRNA，这样Cas9n可以在DNA的两条链上同时形成缺口，产生一种特殊的DSB。由于这种特殊的DSB只有当突变位点两端互补的DNA单链同时出现缺口时才会形成，诱导形成基因突变，所以极大降低了脱靶作用，提高了CRISPR/Cas9对于目标基因靶序列的特异性。利用Cas9n对靶位点进行基因突变的特异性要比野生型的Cas9介导的基因突变要高200到1500倍。

结语与展望
利用CRISPR/Cas9基因组定点编辑技术可以快速构建转基因细胞系，进而获得性状优良的转基因动物品种。除了对单个基因的定点修饰产生特定的性状改变，CRISPR/Cas9技术还可以对同一基因组中的不同基因进行同时编辑，利用该技术可以研究多个基因的功能及基因间的相互作用机制，甚至可以实现重新构建一条代谢通路的目的，这对于通过动物转基因技术实现对多基因调控性状的改良并培育高产优质新品系具有重要的意义，CRISPR/Cas9技术在转基因动物研究方面具有广阔的发展前景。

作为一种新兴的技术，CRISPR/Cas9系统还有许多未知的方面需要进一步的研究，例如，CRISPR/Cas系统的精细作用机制，Cas9蛋白的催化机制和分子结构，对TypeⅠ和TypeⅢ两型的开发利用，作为一种细菌和古生菌的免疫系统在动物中发挥作用会不会产生副作用，如何进一步提高它的特异性等。毋庸置疑，CRISPR/Cas技术的出现为基因功能和基因组调控研究提供了一个简单、高效的技术，已经成为基因组修饰和动物品种改良的重要工具，将给这一领域的研究带来革命性的变化。（本文节选自《CRISPR/Cas9技术及其在转基因动物中的应用》，参考文献略）