挖掘微生物中的“暗物质” 科学家尝试用新方法探索未知抗生素

另辟蹊径寻找抗生素

Robert Heinzen第一次试图让贝氏柯克斯体菌自己生长却惨遭失败。这种会引发被称为Q热的类似流感状疾病的细菌，通常只在其感染的细胞中分裂。这迫使研究人员不得不在哺乳动物的组织中使其生长出来，并且阻碍了他们研究这种微生物的努力。当上世纪90年代初Heinzen在博士后期间试图找到一种不同的方式培养这种细菌时，他得到的只是半本潦草的笔记。

不过，这个问题让他终日不得安宁。直到2003年，贝氏柯克斯体的基因组被测序出来，同时Heinzen在蒙大拿州哈密尔顿市的美国国立卫生研究院落基山实验室创建了自己的实验室。他认为，基因组能提供关于这种细菌新陈代谢和生长的重要线索。即便如此，Heinzen指导的博士后Anders Omsland还是花费了近4年的时间系统测试过上百种不同组合的培养条件，才找到在细胞外培养这种细菌的完美“食谱”。“当他把培养菌拿给我看时，我本以为那是一种污染物。”Heinzen回忆说。然而，随后几个月的努力证实了他们的成功。

贝氏柯克斯体依然属于少数。据估计，有85%～99%的细菌和古生菌尚无法在实验室中被生长出来。这极大地限制了科学家对微生物生命的了解，并且阻碍了对通常来自细菌的新抗生素的寻找。随着现有药物的耐药性急剧上升，这种研究正变得更加迫切：上个月，世界卫生组织批准一项阻击抗生素抗药性的全球计划，同时一个由英国政府指派的评审小组呼吁全球制药行业投入13亿英镑（合20亿美元）复兴抗生素研究。为寻找新药，研究人员表示，他们需要一些替代方法，以调查一系列未被培养出来的生物体——微生物世界中的神秘“暗物质”。

鸡尾酒培养法

按照惯例，生物学家通过在一系列相当标准的营养物质中生长出某一物种的纯培养物来研究微生物。然而，麻烦在于细菌并不像在自然界中那样生活：它们居住在一个非常宽广的环境范围内，并且通常伴有其他有机体，而科学家一直在试图重新创造这些条件。不过，正如Heinzen和Omsland在他们关于贝氏柯克斯体的研究中所展示的，基因序列能打开一扇门。

Omsland利用测序将细菌在宿主细胞内成功生长时所表达的基因同它们试图独自生长时所表达的基因进行比较。他发现，一套涉及蛋白质合成的基因在苦苦挣扎的细菌内较不活跃。这暗示，向培养基中加入氨基酸和缩氨酸或许有助于细菌变得繁盛。不过，即使在Omsland成功地将细菌的蛋白质合成增加13倍时，它仍然无法分裂。

最终的线索来自证明贝氏柯克斯体能在低氧环境中生存下来的基因。当研究团队将这种细菌放置在5%或者更少的氧气中时，他们最终看到它在生长。“这是至关重要的发现。”Heinzen表示，它不是营养物质，而是环境因素。

自从采用无异种生物混杂或没有宿主的新培养技术，贝氏柯克斯体研究领域得到极大的扩展。通过选择性地打开或关闭基因，研究人员了解了这种细菌是如何同宿主细胞发生相互作用，进而将后者感染并且发生分裂的。“毫不夸张地说，在无异种生物混杂的情况下生长贝氏柯克斯体已经彻底改变了这个研究领域。”澳大利亚墨尔本大学微生物学家、贝氏柯克斯体研究者Hayley Newton表示。这种细菌在空气中具有高度传染性，并且被认为是一个可能的生物威胁。目前，Heinzen的实验室正致力于制造致病基因已被灭活的菌株，以期它们在研发疫苗时能派上用场。

同时，研究人员正在设计针对只在细胞内生长的其他微生物的培养体系。已在华盛顿州立大学就职的Omsland开发出一种针对导致最常见性传播疾病的病菌——沙眼衣原体的无细胞培养体系。他说，目前尚未诱导沙眼衣原体在培养基中分裂，但“我生性乐观”，在贝氏柯克斯体上取得成功为他的希望提供了“燃料”。

微型化的培养物

加速寻找培养“食谱”过程的一种方法是利用微流体芯片。这是一种拥有被不同通道连接起来、使其有可能同时运行很多试验的上千个微小凹槽。在利用此方法培养出一种新的细菌后，来自加州理工学院的Rustem Ismagilov和他的合作者甚至将其命名为isolate microfluidicus 1。

当2012年一群微生物学家发表了一个“最想要的”分类群清单时，Ismagilov已经在研究微流体。当时，他们呼吁科研界生长并且测序在人体内相对常见、同已测序生物体关联较远并且躲避所有培养尝试的微生物。

Ismagilov和他的团队用一种容纳3200个纳升大小的凹槽并且能放在手掌中的设备回应了这种呼吁。他们从一名健康志愿者的肠壁上刮取了样品，然后将其稀释，以至于每个凹槽中仅有一个细胞。通过填满如此多的凹槽，研究人员增加了他们的目标微生物—— 一种颤杆菌克属人体肠道细菌找到进入至少一些凹槽的道路的机会。该团队利用约10个芯片测试各种条件，并且寻找这种细菌的生长。

他们成功地找到了细菌，然后在皮氏培养皿中生长出更多的细菌。这是最想要清单上最早被培养出来的成员之一。进一步的遗传学研究显示，isolate microfluidicus 1被错误地分类，实际上并不是颤杆菌克属。其实，它是一个新的相关菌群的一部分。目前，该团队正在描绘新菌群的特征。

该团队发现，生长这种细菌的一个重要成分是从志愿者肠道内提取出的少量液体。Ismagilov介绍说，能在上千种试验中扩展这个珍贵样品的使用是微流体方法的一个重要优势。另一个优势在于每个初始细胞无须同其他种群竞争。

密歇根大学化学工程师Xiaoxia Nina Lin正利用微流体在人体粪便样品中“追捕”最想要清单上的成员。细菌通常生活在复杂的群落中，并且经常依赖于其他种群。为此，Lin正尝试将两个、三个或四个细胞的无数种组合放在一起并且放置在芯片上，以剖析这些关系，并且找到谁依赖谁。“这是一种很好的工程学方法。”正在帮助Lin获取临床样品的密歇根大学传染性疾病研究人员Vincent Young说，你能快速减少复杂度。

不要培养要测序

尽管取得了这些成功，培养细菌仍是一项复杂且需要碰运气的事情。因此，很多研究人员正在完全绕开它，相反从基因中获取信息。测序手段的进步意味着现在科学家能分析未被培养出来的单个微生物细胞的基因组，而不是像此前那样，测序由很多不同类型微生物构成的群落，然后努力将这些序列重新拼凑回去。

来自美国能源部联合基因组研究院的Tanja Woyke首次对单细胞测序产生兴趣是在十年前一个关键发现产生的不久之后。这个发现是一种来自被细菌感染病毒的酶能被用于制作一种细菌细胞基因组的很多个副本。Woyke想利用测序工具填写生命的微生物树。

她和团队成员采集了来自9个不同生境的样品，包括来自内华达州一处温泉的沉积物和太平洋深海热液喷口的水。他们分离出约200个细胞，对每个基因组进行测序，并且把细胞分成20多个不含有任何被培养出来的代表细菌的新世系。“从被分析的序列和单细胞数量这个角度来说，他们首次真正将单细胞基因组学提高到一个新水平。”德国维尔茨堡大学海洋微生物学家Ute Hentschel说。

去年，来自瑞士联邦理工学院的J?觟rn Piel和他的同事报告称，他们利用单细胞测序和其他技术在海绵中确认了未被培养出来的细菌。这些滤食性生物一直是科学家的兴趣所在，因为它们产生一系列具有抗癌、抗菌和其他药物价值的丰富化学物质。它们还庇护着占据40%海绵质量的密集微生物群落，并且被推测是这些化学物质的来源。不过，这些群落的成员一直未被培养出来。

Piel和他的团队将关注点放在Theonella swinhoei海绵上。其庇护着约1000种细菌，并且产生几十种具有生物活性的已知化合物。2011年，他们开始对从海绵样品中分离出来的单个细菌细胞的DNA进行测序，并且找到两个已知涉及具有生物活性的分子生产的基因簇。他们在一种名为Entotheonella的细菌中发现了这些基因。

不过，最令Piel惊奇的是，这种生物体对同海绵相关的几乎所有具有生物活性的化合物负责。当序列数据显示这种细菌庇护着所有必要基因时，这一点变得清晰起来。在Piel从他的合作者那儿接收到关键数据时，“我几乎从椅子上跌下来”。这是一种未被培养出来的细菌能成为具有生物活性的化学物质的如此“天才”生产者的首个证据。“在单一菌株中创造很多不同化合物的能力并不常见。”Piel说。

目前，Piel的实验室正试图将来自Entotheonella的基因簇改造成一种可以培养的生物体比如大肠杆菌，从而使宿主能大量生产化合物。他还在挖掘来自日本、巴布亚新几内亚和以色列的海绵细菌基因组，以期寻找其他细菌超级生产者。