新型单细胞外显子组测序法

导读：

最近，美国MD安德森癌症研究中心和德克萨斯大学休斯敦健康科学中心的研究人员，开发出一种新型单细胞外显子组测序方法称为SNES。与目前大多数单细胞测序方法形成对比，SNES利用细胞核而不是细胞进行分析，从而将会在生物学许多不同领域具有广泛的应用。相关研究结果发表在2015年3月25日的国际著名学术期刊《Genome Biology》。

单细胞测序方法可让我们深入阐述罕见细胞亚群和复杂细胞混合物的基因组，但目前存在的广泛技术错误和不良物理覆盖数据带来了一定的挑战。虽然单细胞RNA测序方法的开发已经取得了一定进展，但全基因组DNA测序方法的开发，已被证明更具挑战性，因为单细胞含有每个mRNA分子的数千份拷贝，但只有每个染色体的两个拷贝。因此，每个细胞只能提供两个模板DNA用于全基因组扩增反应（WGA），所有后续的分子会继承第一轮扩增中发生的错误。

在这项研究中，该研究小组开发了一种新型单细胞外显子组测序方法，称为SNES，这种方法可以实现来自单个哺乳动物细胞的外显子组数据的高覆盖率（96%）。从这些数据我们发现，我们可在碱基对的分辨率上，准确地检测SNVs和缺失。

在覆盖范围改进方面的技术性能是由于多种因素，包括一种改进的Phi29聚合酶、时间有限的等温扩增和使用22染色体qPCR板以在外显子组捕获和测序之前消除具有不良WGA性能的细胞。

与该研究小组以前的方法相反，SNES消除了文库构建对于Tn5转座酶的需要，这可能会向人类基因组中引入整合偏见，并导致覆盖不均匀。通过用一种改进的phi29聚合酶进行限时的等温MDA，研究人员能够减轻FP和FN的错误率，从而提高SNVs和缺失的检测效率。重要的是，SNES程序可消除用于细胞分离、WGA和文库构建的商品化试剂盒，从而将产生单细胞库的成本减至大约为30美元每细胞（不包括外显子捕获试剂和测序成本）。这将让研究人员能够分析和复用大量细胞，这是大多数单细胞测序研究的目标。

在这项研究中，研究人员直接比较了来自G1/0和G2/M期单细胞的数据，表明这两类细胞的覆盖均匀性和广度表现良好。然而，这些数据表明，使用G2/M期细胞会导致等位基因丢失率更进一步的的技术改进。在未来，可以通过SNES与微流控平台相结合来实现（例如，Fluidigm）技术的进一步改进，当纳升体积用于MDA反应时这可以减少误差。

与目前大多数单细胞测序方法形成对比，SNES利用细胞核而不是细胞进行分析。比起使用细胞来说，使用细胞核有几个优点：（1）细胞核可以用DAPI染色并且是封闭的，可避免收集已经分解、凋亡或复制的细胞；2）细胞核可更准确地存放以避免测定多个细胞；（3）细胞核可以从已存储几十年的冷冻组织样本中分离。最后一点是储存组织单细胞测序的关键，因为冷冻可断裂多数细胞的细胞质膜，但唯有核膜是完整，细胞核悬浮液可以容易地制备。然而，细胞核也有几个明显的局限性，包括可能丢失来自微核的DNA，细胞表面标记物不能用来隔离特定的种群（例如，通过流分类种进行浇注）。因此，选择使用细胞核还是细胞，将在很大程度上取决于研究项目的具体要求。

最后，研究人员预计，SNES将会在生物学许多不同领域具有广泛的应用，包括癌症研究、微生物学、神经生物学、发育和产前基因诊断，并会显著提高我们对于人类疾病的基本认识。

本文来源于：生物通

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