硬叶兜兰叶绿体DNA SSR反应体系的优化及引物筛选

本研究以硬叶兜兰为试验材料，通过改良的CTAB法提取总DNA，运用5因素4水平的正交试验设计，综合采用直观量化分析和方差分析两种方法，分析模板DNA用量、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶用量五个因素对cpSSR-PCR扩增的影响，比较不同组合扩增效果的差异，最终确定优化的硬叶兜兰cpSSR-PCR反应体系；并通过梯度PCR确定最佳退火温度。研究结果表明，以DNA模板用量对扩增反应的影响最大，Mg2+浓度的影响最小；较优的反应体系为：模板DNA 45 ng、dNTPs 0.2 mmol/L、引物各0.6 μmol/L、Mg2+ 2.5 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.4 U、10× PCR-Buffer，总体积10.0 μL。本研究采用该体系对采自滇东南7个居群的12份样本扩增验证其稳定性，并从33对引物中筛选出扩增条带清晰、具明显等位基因、特异性好的12对引物。研究结果说明该优化体系能较好地对硬叶兜兰居群个体遗传差异进行分析。