农业部公开MIR162玉米环境和食用安全
编者按：因为屡次遇到中国海关退运，先正达公司研发的转基因玉米MIR162一直为国内外所关注。直到2014年12月，中国农业部方批准进口。
2014年12月初，农业部网站“权威关注”栏目更新了农业转基因生物安全评价资料，其中包括转基因抗虫玉米MIR162安全评价资料。
该评价资料正式名称为农业转基因生物安全评价申报书，即项目“转 vip3Aa20 基因的抗虫玉米 MIR162 进口用作加工原料”申报书。该申报书填报日期为2014 年 2 月 28 日 。以下为该申报书中的“MIR162玉米环境和食用安全性综合评价报告”部分，有删减。原文下载链接：http://www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/spxx/201307/P020150107514619361943.pdf
MIR162玉米环境和食用安全性综合评价报告
先正达公司研制的MIR162玉米通过土壤农杆菌介导转化方法导入了编码Vip3Aa20杀虫蛋白的vip3Aa20基因和编码磷酸甘露糖异构酶(PMI)的manA(pmi)基因。Vip3Aa20蛋白对玉米的一些重要鳞翅目害虫具有杀虫活性。PMI作为培育MIR162玉米的选择性标记。
Southern杂交和DNA序列分析结果表明，MIR162玉米含单拷贝的vip3Aa20和manA基因，不含有任何转化质粒pNOV1300的骨架序列，构建的功能元件在转化过程中保持了完整性，vip3Aa20和manA基因均按单基因的孟德尔分离比例遗传。
先正达公司已开展了大量研究评价MIR162玉米的环境安全性。相关试验数据表明MIR162玉米对环境没有产生不利影响。据先正达所知，尚没有任何报道或现象表明MIR162玉米将直接、间接或累积地对人类环境产生不利影响。对MIR162玉米进行的实验室、温室和田间试验，没有现象表明其种子、花粉、植株形态或成分参数发生改变从而提高了受体植物有害化的风险。玉米生态系统中的多种非靶标代表生物物种暴露于Vip3Aa蛋白都没有产生与处理相关的不利效应。
同时，先正达公司开展了大量研究评价MIR162玉米的食用安全性。相关试验数据表明MIR162玉米(及其制造的饲料和食物)与常规玉米没有本质上的不同，两者具有等同的食用安全性和营养价值。MIR162玉米表达的Vip3Aa20和PMI蛋白在玉米籽粒中含量很低，通过膳食摄入的量非常微小。小鼠急性口服毒性试验表明，Vip3Aa20和PMI蛋白分别在1250mg/kg体重和3080mg/kg体重的剂量下没有表现毒性效应。Vip3Aa20和PMI蛋白在含胃蛋白酶的模拟胃液中被很快降解。Vip3Aa20和PMI蛋白在65oC孵育30分钟后均失去活性。此外，经过氨基酸序列比对发现，Vip3Aa20和PMI蛋白没有与任何已知或假定毒性蛋白或过敏原蛋白的氨基酸序列具有生物学意义的显著相似性。营养成分分析表明，MIR162玉米和常规玉米籽粒和秸秆的营养成分没有显著差异，具有实质等同性。
2011年由中国农业部指定国内检测机构对MIR162进行了本地环境安全和食品安全测试。结果显示，MIR162玉米在生存竞争能力和对生物多样性的影响上与非转基因对照没有显著差异。90天大鼠喂养实验表明MIR162玉米对动物没有产生不良影响。
综上所述，大量的试验结果表明MIR162玉米不会对人类和环境产生有害影响。
背景介绍
先正达公司通过土壤农杆菌介导转化方法筛选培育得到了MIR162玉米。MIR162玉米表达的Vip3Aa20蛋白是苏云金芽孢杆菌株系AB88天然杀虫蛋白Vip3Aa的一种变异体，对玉米的一些重要鳞翅目害虫具有活性。manA(pmi)基因编码的PMI则作为培育MIR162玉米的选择性标记。
MIR162玉米包含一个完整且单拷贝的T-DNA插入子，没有来自转化质粒pNOV1300的骨架序列。MIR162玉米的插入序列没有破坏任何已知的玉米内源基因。对MIR162玉米几个世代的Southern杂交分析表明，单拷贝插入子可以稳定遗传。对MIR162玉米几个世代的vip3Aa20和manA基因的分离比率的观察符合孟德尔遗传定律，也证明了转基因可以稳定遗传。总之，MIR162玉米中T-DNA插入子没有发生任何意外变化。
MIR162玉米表达的Vip3Aa20杀虫蛋白对小地老虎(A.ipsilon)、玉米穗蛾(H.zea)、豆白缘切根虫(S.albicosta)和草地夜蛾(S.frugiperda)的幼虫具有较强毒性。MIR162玉米的Vip3Aa蛋白与抗玉米螟玉米结合起来，为种植者提供了一种防治多种鳞翅目害虫危害的方法。这种新抗虫性的商业化能够减少玉米常规杀虫剂的使用，提高种植者的效益。
MIR162玉米已在多个国家获得批准进行商业化种植，包括主要的玉米出口国美国、加拿大、巴西和阿根廷。这几个国家也同时获得了MIR162玉米用于食品或饲料加工的审批。除此之外，欧盟、澳大利亚、新西兰、俄罗斯联邦、印度尼西亚、墨西哥、日本、菲律宾、韩国、中国台湾等国家和地区也批准了MIR162玉米用作食品、饲料或加工原料。
大量研究资料及国外应用实践表明，MIR162玉米对生态环境和人类健康没有不利影响。
受体生物
1受体生物分类地位与分布
受体植物为栽培玉米，学名为ZeamaysL.，俗名为玉米，也称为玉黍、苞谷、棒子等。在植物分类学上属于单子叶植物的禾本科、玉蜀黍属、玉米种、栽培玉米亚种。玉米是西半球起源的少数主要作物种类之一，世界各地几乎都有种植。现代玉米的确切起源多年来一直是植物学家争论的话题，尽管有证据支持起源于野生墨西哥类蜀黍和人类干预的理论。玉米确定不是起源于中国，引入中国的确切时间尚无定论，但根据研究，玉米大约是在1511年前若干年引入中国的，因为公元1511年《颍州志》中有关玉米的记载。
2在自然界中生存繁殖能力
玉米是一年生植物，被认为没有也不可能演化为杂草。籽粒(种子)是唯一有生存力的组织。玉米籽粒的生存取决于温度、籽粒的湿度、基因型、苞叶的保护和发育阶段。极冷的温度对玉米种子发芽有不良作用，被视为玉米种子生产的主要危险。有报告说，高于45C的温度对玉米种子的成活力也有损害。在玉米开花期持续高温(38C以上)会影响花粉的生活力，进而降低玉米的结实率。玉米是比较耐旱的作物，其抗旱性主要表现在苗期，但玉米的耐盐性不高。栽培玉米作为完全驯化的植物，没有人类的管理，不能存活。
3抗病、虫、草性
玉米品种间由于遗传背景不同，对玉米病虫害的抗性存在很大的差异。通过人们的多年选育，通过常规育种方法，已培育出对不同病虫害有不同程度抗性的品种，但尚未见有对杂草有抗性的玉米栽培种。
4落粒性与自生苗
由于玉米穗的构造，籽粒生长在穗轴上，外面还有苞叶包被，籽粒很难自行脱落，单个种子的扩散在自然界很难发生。田间遗落的雌穗是因玉米植株倒折后所致，出现的自生苗也常于雌穗遗落位置成簇出现，较难发育成正常的植株发育至成熟。
5安全应用史
人类食用玉米已有上千年的历史了，玉米提供给人类生存所需要的各种营养。因其漫长的栽培历史，玉米已经具有与周围生态环境共存的特性，因此，玉米对生态环境中的许多生物是安全的。从玉米栽培到目前为止，有文字记载的历史中，没有有关玉米对人类健康和其它生物产生不利影响的记载和报道。
作为人类的基本食物之一，很多地区的人们使用玉米来制备面包、小吃和发酵食品，目前，人们食用玉米所产生的健康问题，是由微生物毒素和致病性微生物引起的，并不是玉米本身所造成的。因此，玉米具有长期安全食用的历史。
作为受体植物的玉米不会对人类的健康产生危害或不利的影响，根据农业部“农业转基因生物安全评价管理办法”第九条的规定受体植物玉米的安全等级应为I级。
基因操作
MIR162玉米转化所用载体为pNOV1300，大小为14405bp，载体是安全的，无致病性。pNOV1300由pBS12改造而来，pBS12由JapanTobacco，Inc.提供。pBS12由常用的人工载体pBR322改造而来，而pBR322载体已经有很长的应用史。pBR322的元件来源于大肠杆菌，大肠杆菌是一种普遍的细菌，属于肠杆菌科，与杆状菌属同类，是革兰氏阴性菌。大肠杆菌广泛存在于环境中，而且在脊椎动物包括人类的消化系统里也能找到。
MIR162玉米插入序列来自pNOV1300载体的T-DNA区域，长度为为8.4kb，包含vip3Aa19和manA基因表达盒，其结构如附图14所示。Vip3Aa19表达盒由玉米ZmUbiInt启动子和花椰菜花叶病毒35S终止子序列调控的vip3Aa19编码区组成。manA表达盒由玉米ZmUbiInt启动子和胭脂碱合成酶NOS终止子序列调控的manA基因编码区组成。
vip3Aa1基因的来源是苏云金芽孢杆菌。苏云金芽孢杆菌长期以来被用作生物农药制剂，至目前为止，尚无任何对人类和动物的致病性报告产生，具有安全使用历史。manA基因来源是大肠杆菌株系K-12。大肠杆菌在自然界和人类器官上广泛存在，人类更经由食物间接地摄食到此菌，而大肠杆菌株系K-12至目前为止尚无任何致病性报告产生。此外，PMI蛋白在自然界中几乎无所不在，包括各种农作物和动物。因此，PMI也不存在任何使用安全性问题。
通过对几个世代的MIR162玉米进行Southern杂交分析和对vip3Aa20和manA基因进行遗传分离比分析，确认MIR162玉米中导入的目的基因已稳定整合入玉米基因组，且可以稳定的遗传。
利用特异性vip3Aa19探针，通过Southern杂交分析了MIR162玉米BC1F1、BC2F1和BC4F1世代的植株。分析结果显示，几个世代MIR162玉米的杂交带型表现一致，表明vip3Aa20基因在世代间的稳定性。因此，在常规育种多个世代间MIR162玉米的插入片段是稳定遗传的。
环境安全评价
生存竞争能力
2005年和2006年生长季，在美国对MIR162玉米进行了农艺性状观察试验。结果表明，MIR162玉米和对照在所调查的农艺性状没有观察到显著差异。同时，MIR162玉米在生殖方式和生殖率、传播方式、休眠性、适应性等方面，与常规玉米相比没有显著差异，没有证据表明基因操作改变了MIR162玉米的生存竞争能力及增加了其杂草化的趋势。
此外，由农业部指定，农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(北京)于2011年对MIR162玉米进行了生存竞争能力检测。结果表明，MIR162玉米与其对照(NP2222/NP2171)相比，荒地生存竞争能力和栽培地生存竞争能力没有显著差异。具体调查项目包括:在荒地和栽培地条件下，MIR162玉米与其对照(NP2222/NP2171)的出苗率、长势、株型、株高、覆盖率、生育期及雌穗重等，
以及收获籽粒的发芽率。综上所述，MIR162玉米和非转基因对照在生存竞争力及转变为有害生物方面没有差异。
对生物多样性的影响
在一系列实验室生物分析试验中，将可能接触MIR162玉米所含Vip3Aa20蛋白的13个非靶标生物代表物种暴露于Vip3Aa的几种蛋白变异体，研究结果证明，没有发现与蛋白处理相关的不利效应。
农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(北京)于2011年对MIR162玉米进行了生物多样性影响检测。结果表明，转基因玉米MIR162对田间节肢动物多样性，在物种生态优势度、捕食性天敌总量、寄生性天敌总量、非靶标害虫种群动态上，与其非转基因对照相比没有显著的影响，说明转vip3Aa20基因的MIR162抗虫玉米对玉米田昆虫群落没有明显的影响。
上述研究结果表明，转vip3Aa20基因MIR162抗虫玉米同非转基因对照相比，对其它非靶标害虫及有益昆虫的种群数量，没有显著的影响，对玉米田间节肢动物多样性也没有显著影响。同时在对玉米主要病害的发生程度上，亦没有加重的情况发生。
基因漂移
玉米能与称之为大刍草的分类群杂交。大刍草可分类成Zeamays亚种，其余的被认为是Zea的个别种。大刍草原产地在中美洲，与栽培玉米共存了几千年。尽管大刍草与栽培种之间偶尔也有基因渗入现象，但他们在遗传上仍隔离(USEPA，2001)。大刍草不是中国的本地物种，没有大量栽培。因此大刍草在自然条件下与MIR162杂交的可能性极小。
vip3Aa20基因的密码子经过优化得以在植物中表达，因此该基因序列与土壤微生物的基因序列同源的可能性很低。因此，vip3Aa20基因从MIR162玉米向土壤微生物的水平基因转移几乎是不可能的。如果的确发生转移，vip3Aa20的表达也是不可能的，因为vip3Aa20基因的表达由玉米的ZmUbiInt启动子启动，而该启动子不太可能在微生物中发挥功能。因此，vip3Aa20基因在玉米田通过水平基因转移传播的可能性几乎不存在。
食用安全性评价
营养学评价
对MIR162玉米及非转基因近等基因系对照玉米的秸秆和籽粒中65种重要的营养成分进行了比较。结果表明，MIR162玉米籽粒和秸秆的成分和营养价值没有发生因转基因或Vip3Aa20或PMI蛋白表达产生的非预期的、具有生物学意义的变化。MIR162玉米与对照之间观察到的少数差异是典型的随机变异，且差异很小。所有MIR162的值都在常规玉米的正常历史范围内，且范围与对照数据范围相当。因此，MIR162玉米在营养成分上与常规玉米没有差异，具有实质等同性。
毒理学评价
MIR162玉米中导入了Vip3Aa20基因和manA基因，在转基因玉米中产生两种新的蛋白Vip3Aa20和PMI。
Vip3Aa20不为毒性物质的证据包括:1)Vip3Aa20只对某些鳞翅目昆虫具有特异杀虫活性，对哺乳动物无害;2)Vip3Aa1蛋白在农业上有安全使用的历史;3)Vip3Aa20在65oC温度下会失去稳定性;4)Vip3Aa20在哺乳动物胃液环境中被很快降解;5)Vip3Aa20不与任何已知或假定毒性蛋白的氨基酸序列具有同源性;6)按每公斤体重1250mg的Vip3Aa20饲喂小鼠，高剂量蛋白测试结果显示为无毒性。
PMI不为毒性物质的证据包括:1)PMI广泛存在于自然界的多种生物中;2)PMI已有安全使用的历史;3)PMI在65oC及更高温度下表现为不稳定;4)PMI在典型哺乳动物胃液环境中很容易被降解;5)PMI不与任何已知或假定毒性蛋白的氨基酸序列具有同源性;6)按每公斤体重3080mg的PMI饲喂小鼠，高剂量蛋白测试结果显示为无毒性。
因此，可得出的结论是:MIR162玉米表达的新蛋白不可能为毒性物质，MIR162玉米与常规玉米具有等同的食用安全性。
在国内全食品90天的饲喂试验中，根据《食品安全性毒理学评价程序和方法》和农业部农业行业标准《转基因植物及其产品大鼠90天喂养试验》，农业部转基因生物食用安全监督检验测试中心(天津)进行了MIR162玉米及常规对照玉米的90天大鼠喂养试验，用以评价MIR162玉米的对大鼠的亚慢性毒性。试验中将MIR162玉米和常规对照玉米分别掺入饲料(比例为50%、225%、12.5%)中喂饲大鼠90天。试验结果显示:饲喂期间动物活动自如，被毛有光泽，鼻、眼、口腔无异常分泌物。各剂量组动物的体重、增重、进食量及食物利用率未见异常改变。试验中期和试验末期各项血液学指标(红细胞、血红蛋白、血小板、白细胞计数及分类)、血生化指标(血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素氮、胆固醇、甘油三酯、血糖、乳酸脱氢酶、总蛋白、白蛋白、肌酐、碱性磷酸酶)均在正常值范围内。动物解剖时，大体观察未发现异常。病理组织学检查未见明显病理学改变。由此可见，MIR162玉米和常规对照玉米饲喂大鼠90天，未见其对动物产生不良影响。
致敏性评价
MIR162玉米中导入了Vip3Aa20基因和manA基因，在转基因玉米中产生两种新的蛋白Vip3Aa20和PMI。
Vip3Aa20蛋白不为食物过敏原的证据包括:1)Vip3Aa20蛋白的供体生物不具有过敏性;2)Vip3Aa1蛋白具有安全使用史;3)Vip3Aa20蛋白在65°C以上温度作用后会失去稳定;4)Vip3Aa20蛋白在模拟胃液的作用下会被快速分解;5)Vip3Aa20蛋白不与任何已知或假定过敏性蛋白氨基酸序列具有同源性;6)Vip3Aa20蛋白在植物体内的蛋白含量比例极低。
PMI蛋白不为食物过敏原的证据包括:1)PMI蛋白的供体生物不具有过敏性;2)PMI蛋白具有安全使用史;3)PMI蛋白在65°C及以上温度作用后会失去稳定;4)PMI蛋白在模拟胃液的作用下会被快速分解;5)PMI蛋白不与任何已知或假定过敏性蛋白氨基酸序列具有生物学意义的同源性;6)PMI蛋白在植物体内的蛋白含量比例极低。
因此，可得出的结论是，MIR162玉米表达的新蛋白Vip3Aa20和PMI不可能为食物过敏原。
抗生素抗性
在转基因抗虫玉米MIR162中不存在编码抗生素的基因。
非预期效应：无
生产应用前景及安全监控措施
MIR162玉米表达的Vip3Aa20杀虫蛋白对包括小地老虎(A.ipsilon)、玉米穗蛾(H.zea)、豆白缘切根虫(S.albicosta)和草地夜蛾(S.frugiperda)的幼虫具有较强毒性。MIR162的Vip3Aa蛋白与抗玉米螟玉米结合起来，为种植者提供了一种防治多种鳞翅目害虫危害的方法。这种新抗虫性的商业化能够减少玉米常规杀虫剂的使用，提高种植者的效益。目前MIR162玉米已在美国、阿根廷、巴西、加拿大等国商业化种植。
先正达公司作为技术研发商，严格按照法规和审批文件的要求，在向贸易商发放进口安全证书时要求贸易商承诺进口过程中全程进行监控，并对监控措施提出具体要求，在必要时提供技术指导和支持。在发放安全证书时会记录贸易商的联系方式等信息，以便后续监督。同时，要求下游转基因玉米的加工企业在生产过程中采取相应的安全监控措施。通过以上措施，确保这些转基因玉米仅被用作加工原料，不会被误作种子或它用，或泄漏到环境中产生潜在的风险。
结论
在国内与国外所进行的一系列研究表明，转基因玉米MIR162对靶标害虫具有显著抗性，而对非靶标生物、生态环境等没有不利影响。同时营养学、毒理学及致敏性研究也未发现对人类及动物产生不利影响。
附：该类转基因植物国内外生产应用概况
MIR162玉米为种植者提供了对几种特定鳞翅目害虫的抗性，其新的作用机制不仅能为种植者在高效、便捷的保护玉米免受鳞翅目害虫危害方面提供新的选择。而且将MIR162玉米与抗玉米螟玉米结合起来，为种植者提供了一种防治多种特定鳞翅目害虫危害的方法。这种新抗虫性玉米的商业化能够减少常规杀虫剂的使用，保护环境，提高种植者的效益。
截至2013年，MIR162玉米已在17个国家或地区获得批准用于种植、食用或饲用，主要包括美国、加拿大、巴西、阿根廷、欧盟、澳大利亚、新西兰、俄罗斯联邦、印度尼西亚、墨西哥、日本、菲律宾、韩国、中国台湾等。
转基因生物进口过程中拟采取的安全防范措施
MIR162玉米仅涉及进口用作加工原料安全证书的申请。根据农业部要求，在国内由指定检测机构进行了小规模控制下条件下的MIR162玉米环境安全检测。试验方案由检测机构依据相关法规要求及技术标准制定。检测机构拥有完备的转基因植物田间试验所需的场地、人员及技术等条件。
我国已颁布《农业转基因生物安全管理条例》及配套的管理办法等法规文件，要求转基因植物的进口、生产和经营等活动具备相应的安全监控措施。先正达公司作为技术研发商，严格按照法规和审批文件的要求，在向贸易商发放进口安全证书时要求贸易商承诺进口过程中全程进行监控，并对监控措施提出具体要求，在必要时提供技术指导和支持。在发放安全证书时会记录贸易商的联系方式等信息，以便后续监督。同时，要求下游转基因玉米的加工企业在生产过程中采取相应的安全监控措施。通过以上措施，确保这些转基因玉米仅被用作加工原料，不会被误作种子或它用，或泄漏到环境中产生潜在的风险。
向贸易商发放安全证书的管理
先正达向贸易商发放安全证书时，要求贸易商签订协议，承诺严格按照法规和审批文件的要求履行安全监控的义务。要求贸易商承诺并做到:
遵守所有有关贸易或用到生物安全证书活动的法律条款和规定;进口的转基因玉米产品仅作为加工原料，决不能作为研发或种植材料;承诺履行安全控制职责，确保进口的转基因玉米产品不会释放到环境中或者对生物多样性、可持续利用或人类健康产生潜在的风险;必须遵照以上条款使用生物安全证书。若贸易商不履行承诺的条款时，先正达公司拥有撤回生物安全证书的权利。
此外，先正达公司还详细记录并保存所有申请安全证书复印件的贸易商的信息，包括公司名称、地址、联系人信息，以便更好的对使用先正达公司安全证书的贸易商进行监督。
要求贸易商在进口过程中采取的监控措施
先正达对贸易商在进口过程中采取的监控措施提出要求，必要时提供技术指导和支持。对运输车、船和包装提出要求，转基因材料需装在双层容器中运输以防流失，并明确标识，确保在运输和装卸过程中不出现撒、漏现象，避免转基因玉米进入环境中。具体要求贸易商在运输、储存与加工流程中，对转基因植物必须做到:
转基因植物种子必须装在双层容器中运输以防流失;转基因植物必须用安全的方式进行储藏和处理，绝不能释放到环境中;为防止转基因植物与非转基因植物意外混合，要有统一的标识管理方案，例如清楚的转基因标识、彩色喷码、将转基因植物隔离存放等。
要求加工企业在生产过程中采取的监控措施
要求转基因玉米加工企业对生产过程进行监控。特别是在城乡结合部周围有农田的加工企业，督促他们及时清扫散落在外的转基因玉米籽粒，拔除可能出现的散落玉米自生苗。转基因材料需隔离存放。对废弃物按要求集中焚毁或深埋处理。为避免因人为操作可能造成转基因玉米的外源基因向栽培种飘移的发生，可限定在加工企业周围300米范围内，不得有玉米制种田或品种选育田，以免散落在加工场地的可能出现的转基因玉米自生苗生长成株后，花粉向周围制种田扩散。
