Nature Methods：新一代CRISPRs有望成为2015年重磅技术

当人们提到所谓的使能技术（enabling technologies），类似印刷机的发明，或者麻醉药的发现就会浮现在我们脑海中。而对于科学家来说，CRISPR-Cas9 系统就是这样一种系统。

这种细菌免疫系统能通过将病毒DNA中的短重复片段整合到细菌基因组中，来抵抗病毒。当细菌（或其后代）第二次感染病毒的时候，这些重复序列就能通过一种核酸酶靶向侵入的互补DNA，并摧毁它。

2013年几个研究组就利用了这一系统编辑真核生物基因，随后看到在不少应用中CRISPRs迅速崛起，多个不同物种都实现了基因组中基因删除和插入，激活或抑制基因转录。但是随着这一系统越来越受欢迎，关于其特异性和有效性的质疑也越来越多。

如何提高导向RNA（gRNA）的特异性是一大问题，这种RNA能将Cas9 核酸酶带领到基因组目标位置，Nature Biotechnology杂志建议切断gRNAs (Nature子刊：巧解基因编辑脱靶问题)，减少脱靶问题，而且不影响靶标活性，而另外一个研究组则建议更长一些的gRNAs (Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases)。

这明显是有些自相矛盾的建议，前者的研究人员指出只是简单截短了gRNA靶标区域的长度，结果发现在之前检测到的脱靶位点，脱靶突变都大幅减少，与全长gRNA相比，一些位点的突变频率甚至减少了5,000倍以上。重要的是在靶向它们的预定目标DNA时，这些缩短了的gRNA（称为tru-gRNA）与全长gRNA同样有效。而后者则发现选择合适的靶标序列，优化gRNA和Cas9，就能避免或者减少脱靶突变的出现。

另外一个问题是如何筛选脱靶，以及中对于研究的影响有多少。可以验证gRNAs错配候选位点的方法也许会错失一些关键的剪切位点，而且全基因组测序也不是非常有效，目前我们需要一种敏感且无偏差的方法，来标记Cas9 靶标位点，并令它们能在整个基因组中被识别出来。

其它的令这一系统特异性更强的方法还有，用配对替换切口酶（nickases）替换Cas9 核酸酶（前者每次只能切断DNA一条链），或者将 Cas9突变融合到Fok1 这种需要催化激活的核酸酶中去。此外，通过来自不同物种的Cas9也能增加靶向多个位点的灵活性，进一步改善 Cas9-gRNA 复合物的传递系统，也有助于增加效率。

尽管Cas9潜力无限，但是这还是一种细菌的蛋白，对于一些应用，尤其是临床上的应用来说，还需要寻找真核生物核酸酶进行替换。对于植物来说，一些Argonaute 核酸酶能通过小RNAs靶向DNA，这也是基因组编辑可以考虑的一个方向。