替代PCR-RPA技术大展身手

重组酶聚合酶扩增RPA被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA扩增的速度非常快，灵敏度高，对硬件设备要求低，而且不需要复杂的样本处理。这样的技术特别适合于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御、农业等领域。

RPA技术在HIV中的应用

在HIV诊治中，即时检测是非常重要的，对婴儿来说更是如此。有案例显示，HIV感染后立刻进行治疗就能控制住患者体内的病毒，让它们无法进行复制。举例来说，生来就携带HIV的密西西比婴儿，在出生后立即得到了治疗。后来这个孩子停药了两年多，病毒复制依然得到了控制。

目前婴儿HIV诊断的金标方法是DNA PCR，但许多地区并不具备这样的条件。在这种条件下，RPA技术正好可以大展身手。

纸做的HIV DNA检测装置

2012年九月，研究人员开发了一个由纸、玻璃纤维和塑料制成的装置，用来对HIV的DNA进行RPA扩增。这个装置成本低、小巧轻便、而且易于使用，只需五步就能搞定HIV检测。扩增结果可以通过侧流层析试纸来读取。

人们可以先从婴儿的干血斑样本中提取DNA，然后再进行RPA扩增。研究显示，用这个装置进行RPA扩增反应，能在十五分钟内将10拷贝的HIV DNA扩增到可检出的水平。可见，这是一个前景广阔的低成本即时检测装置。

RPA检测HIV DNA的实战效果

如果不能及时检测婴儿体内的HIV-1，就会延误治疗并影响治疗效果。2013年的一项研究设计了靶标HIV-1基因组不同区域（长末端重复LTR和 pol）的两种探针。研究人员用这两个探针分别进行RPA扩增，然后进行荧光检测和侧流层析试纸检测。研究表明，这样的方法能够可靠地检测到3拷贝的前病毒DNA。研究人员在此基础上测试了多个HIV-1突变株，pol和LTR引物的扩增率分别为98.6%和93%。

这是一个能检测出HIV-1所有主要亚型的等温扩增法，能够在资源匮乏的地区帮助人们诊断携带被HIV感染的婴儿。

HIV DNA的实时定量检测

今年五月，研究人员使用内参和标准曲线，通过RPA扩增定量了HIV-1 DNA的浓度。这是一种基于实时荧光数据的定量RPA技术，被称为qRPA。

这项研究通过一系列试验，分析和定量了不同浓度的HIV-1 DNA样本。研究显示，在所有测试的浓度范围内，qRPA的预测值与正确值在一个数量级以内。可见，定量RPA (TwistAmp exo) 可以作为核酸定量的有力工具，用于即时检测和体外诊断。

不插电的HIV DNA检测

绝大多数核酸扩增（包括等温扩增）都需要电。但在资源匮乏的区域，最好是有不需要持续供电的诊断工具。RPA的工作温度在25-43°C之间，不需要严格控制孵育温度，就能达到理想的性能。

今年九月的一项研究显示，当室温在31°C - 43°C之间时，孵育20分钟RPA反应就能成功进行，检测到10拷贝的HIV-1前病毒DNA。

当室温降到30°C以下时，RPA的扩增性能有所下降。为此，研究人员开发了一个简单的化学加热器，在室温10-30°C时孵育HIV-1 RPA反应。研究显示，RPA的性能通过加热孵育得到了恢复，能检测到10拷贝的HIV-1前病毒DNA。

研究人员在15°C、20°C、25°C和30°C，用这种加热器进行了12个RPA反应，结果全部扩增成功。他们还发现，当温度较低时，孵育30分钟能促 进RPA的扩增性能。研究表明，对RPA HIV-1反应进行化学加热，与电力设备效果差不多。这也说明，RPA HIV-1检测不需要多好的设备，就可以实现高灵敏度的诊断。

RPA技术在癌症领域的应用

自人类对癌症“宣战”以来已经过去了四十多年，这种恶性疾病仍旧是一团挥之不去的阴影。统计数据表明，2012年世界上有15%的死亡是癌症造成的。随着发展中国家逐渐接纳西方国家的饮食和生活方式，这一数字在未来几十年中肯定还会上升，这无疑给发展中国家敲响了警钟。

RPA用于癌症突变检测

新加坡A*STAR的研究团队去年六月在Lab on a Chip杂志上，发表了一种能够快速检测癌症单点突变的新技术，等温固相扩增/检测（ISAD）。这是一种无需标记的实时检测技术，将基于硅基微环 （silicon microring）的固相扩增与等温重组酶聚合酶扩增（RPA）结合在一起。

在这项研究中，ISAD主要用于检测 HRAS（Harvey RAS）基因的单点突变。在固相扩增阶段，引物直接连在设备的表面。在扩增过程中，硅基微环谐振器会发生光的波长漂移，在此基础上就能对扩增DNA进行检 测，不需要任何标记。（延伸阅读：核酸检测的一场革命，可替代PCR的犀利技术）

研究显示，与RPA和传统PCR方法相比，ISAD技术的灵敏度要高一百倍。这个技术能够在扩增过程中区分HRAS基因的一个单点突变。由此可见，ISAD能够用于突变、单核苷段多态性和癌症指标的检测。

RPA用于抗癌药物筛选

去年十月，Talanta杂志上也发表了一项用到RPA技术的癌症研究。该研究在超灵敏生物条码分析（BBC）、适配体（aptamer）和RPA的基础上，开发了一个检测细胞色素C（Cyto-c）的新生物条码分析法（ABC）。细胞色素C是细胞死亡的重要标志物。

适配体是一种单链短DNA，它折叠形成的3D结构能够结合特定的目标分子，具有高亲和力和特异性。

研究人员在BBC分析的基础上进行优化，采用了Cyto-c特异性的适配子，并用等温重组酶聚合酶扩增（RPA）替代了耗时长的PCR。研究显示ABC 分析的检出限低至10ng/mL，而且可以在三小时内完成。研究人员用ABC方法对一些潜在的抗癌药物进行了体外测试，检验了它们对不耐药和多重耐药性肝癌的杀伤效果。

RPA在二代测序中的应用

大规模并行测序技术（即二代测序NGS）是基因组和遗传学领域的一次技术革命。NGS自诞生以来，不论是测序规模还是测序效率都有了飞速的提升。尽管这一技术已经取得了巨大的成功，但有着极端碱基组成的基因组区域，对于目前的NGS平台来说仍然是一个很大的挑战。

不少重要的病原体都具有极端的碱基组成，比如疟原虫（高AT含量）和结核杆菌（高GC含量）。PCR扩增是标准的文库制备程序，不过PCR会导致不均匀的读 取覆盖度（特别是在富含AT和GC的区域），最终影响基因组的装配和变异分析。而省却PCR扩增的文库制备方案，需要大量的初始材料，不适合处理从临床上 分离的样本。

为此，Wellcome Trust Sanger 研究所的研究团队对测序文库的制备进行了优化，找到了既适合低量样本又耐受高AT含量的文库制备方案。这项研究发表在2012年的BMC Genomics杂志上。

研究人员用非临床和临床分离物（含大约53%的宿主污染物）制备Illumina测序文库，分别使用了不同的聚合酶、PCR和RPA方法，并对测序结果进行了分析和比较。他们在此基础上增强了高AT含量区域的测序覆盖度，减少了极端碱基组成带来的偏向性。

这项研究的RPA等温扩增直接使用了TwistAmp基础反应，没有进行任何优化。结果显示，RPA制备测序文库时产量相对较高，与标准Illumina文 库制备相比，对极端碱基组成的模板偏向性较少，覆盖度有一定的提升。不过测序后的嵌合和重复读取（chimeric and duplicate reads）相对较多。

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