#单细胞专题# 【单细胞测序技术-解答专场】

以下是当天在线研讨会的Q&A记录： （Q : 提问；A：回复）

Q1：华大用什么平台分离单细胞？

A1：常用的是口吸管法，现在也有流式细胞仪。

Q2：几种单细胞分离方法是啥?

A2：第一种是口吸管法，可视化；第二种是流式细胞仪，通量大；第三种是显微切割，通量低，需要染色；第四种是自动化系统，分选通量高，缺陷细胞损失大。

Q3：请问流式细胞仪标记后转录组会改变么？

A3：对细胞活性可能会有一些影响，损伤活性的细胞不容易扩增成功。转录状态的改变多少会有一些的，这种影响还没有实际的方法可以评估。

Q4：那发文章的时候reviewer会不会质疑这个？

A4：目前发的文章里还没有关于这个问题的质疑和讨论。对于转录组研究，这个问题现阶段还没有办法解决的，不只是单细胞样本，组织样本也一样，都会经过一个样本处理的过程。

Q5：请问MDA法扩增后检测不到CNV吗？为什么？

A5：第一代MDA技术，确实存在扩增的不均一性，所以不适合做CNV的检测。第二代MDA技术，对扩增体系进行了优化，极大地降低扩增偏向性，实现全基因组较均一的扩增（接近无扩增的效果），使MDA有了同时可检测SNP和CNV、SV的可能性。

Q6：单细胞扩增技术都有哪些，各有什么优缺点？

单细胞基因组方面的话，目前常用的技术有三种：MDA、DOP-PCR、MALBAC，其中MDA扩增产物覆盖度高，可达到95%以上，覆盖度优于其他两种方法，扩增片段长，10kb以上，最大可达23kb，错误率低，10的-6次方。DOP-PCR覆盖度低，但适合做CNV变异检测。MALBAC技术适合SNP和CNV检测，但会引入外源引物序列，扩增产物短，基因组覆盖度也比MDA低。

Q7：研究肿瘤进化是单细胞基因组测序和转录组测序 哪个更适合一些？

A7：从基因组的层面来研究比较适合。对肿瘤组织取多个部位或不同时期的肿瘤细胞，进行单细胞群体分析，可以分析出肿瘤发生发展过程中，产生的关键变异。也可以研究肿瘤的异质性。

Q8：第二代MDA kit有哪些?

A8：我们是对MDA技术做了一些改进，商业化kit的话可以搜一下Qiagen的，经过我们改进后的MDA技术，提高了扩增的成功率和覆盖度

Q9：你们用的是哪种技术？

A9：单细胞基因组我们用的是MDA，可以做单细胞全基因组、单细胞外显子、单细胞目标区域测序；单细胞转录组测序，用的是smart技术，可用于全长转录本的检测。这几种方法我们都做了很大的改进

Q10：是自己把DNA扩增之后，送去测序么？

A10：可以给我们组织或细胞，由我们来做扩增、建库、测序。

Q11：能不能简要介绍一下malbac扩增的原理?

A11：该扩增服务华大不提供，所以如果感兴趣可以看一下谢晓亮老师的文章

另外，

Q12：激光显微切割对单细胞的捕获方法成熟吗？能不能比较准确的捕获单个细胞呢？

A12：激光显微切割的技术，前提要对肿瘤细胞进行染色，对细胞会产生比较大的损伤，扩增效果不是很好，另外也比较考验切割技术，如果你切多了，会把其他细胞的胞质也切进来。

Q13：单细胞组学技术在法医学中有应用吗?

A13：法医学上的样品特点是量少，是可以用于这方面的研究。

Q14：有没有成功案例?

Q14：华大发表了2篇单细胞肿瘤文章在cell上，1篇结肠癌单细胞文章在cell

research，另外有两篇做CNV的文章是关于发育的，具体可以看我们官网上，具体有文章内容。链接：http://www.bgitechsolutions.cn/service-solutions/ngs/genomics/human-single-cell-dna-sequencing/

Q15：如果是人体标本,我们对组织不同部位可以进行序列测定吗？可以精确到什么程度？

A15：我们常规的做法是，取不同组织块，组织块的部位是知道的，然后对组织块进行消化、口吸管分离单个细胞、然后扩增，测序，一般由20-30个左右细胞代表这一个组织的基因组情况，当然这个数据可根据异质性的高低进行调整，不是规定死的。至于单个细胞的序列准确性，我们ppt里讲过了，覆盖度高、扩增错误率是10的-6次方。

Q16：请问 单细胞基因组扩增后,测序得data quality 会有影响?Q30的比例明显降低 那么Q30的比例多少以上,算测序的数据质量达标了呢?

A16：如果是MDA，Q30与常规基因组测序差不多；如果是DOP-PCR和MALBAC的话，Q20的数据会有下降，但具体数据我这还没有。

Q17:能不能这样理解:单细胞组学就是解决了单细胞分离和DNA扩增问题之后,

将常规所说的组学技术搬到单细胞中?

A17: 是的，单细胞扩增技术，就是将基因组或转录组扩增到常规组学技术需要的样品量，将单细胞中10pg的量，扩增到ug级别的。

Q18：那单细胞组学的重心不在组学, 而在于单细胞的选择,分离与扩增?

A18：单细胞的分离、扩增是关键，但最终的目的是要了解单细胞组学上的特征。因此，单细胞测序技术是有应用的必要的，癌症的异质性、进化、胚胎发育、生殖细胞异常等。

Q19：请问，不同的单细胞RNA-seq技术，其生物学重复的相关性r值一般在多少呢？

A19：单细胞RNA-seq现在用得比较多的是smart-seq。有测试过同个卵裂球的细胞，基因表达的相关性在90%以上。

Q20：同卵卵裂球差异很小吧，有没有其他的样品的数据呢？

A20：是的，差异很小，正是为了尽量消除细胞间本身的样品差异，评估技术的稳定性。其它样品的类似测试暂时还没有看到。

Q21：现在国内的单细胞RNA-seq是不是只有smart一种方法啊？

A21：基本都是这种。

Q22：汤富酬老师的那种方法什么时候能商业化呢？

A22：这个方法适用的细胞类型有限，而且不能覆盖转录本全长，所以目前主要的是用smart-seq。

Q23：目前单细胞除了DNA\RNA，还能做组蛋白修饰和ChIPSeq么？

A23：蛋白和表观方面还在研究阶段，暂时还没有成熟的商业化技术。蛋白方面暂时还没有，表观方面有乔杰、谢晓亮老师他们发过文章。

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