抗虫杂交稻组合Bt汕优63综合评价报告
基因农业网按：本文系华中农业大学于 2008年10月31日申请的《转cry1Ab/Ac基因抗虫杂交稻组合Bt汕优63在湖北省生产应用的安全证书》相关附件中的《转cry1Ab/Ac基因抗虫杂交稻组合Bt汕优63综合评价报告》。
一、 摘要
转cry1Ab/Ac基因抗虫杂交稻组合Bt汕优63是转cry1Ab/Ac基因抗虫恢复系华恢1号和不育系珍汕97A所配的杂交组合。华恢1号是华中农业大学培育的无标记基因抗虫转基因水稻品系。其原始转化事件为TT51，同于华恢1号的无标记基因株系为TT51-1。
基因操作所用的受体品种是杂交稻恢复系明恢63；所用的目的基因是由中国农科院生物工程中心范云六院士等人工合成的cry1Ab/Ac融合蛋白基因，它的表达产物能够专一而且有效地控制水稻二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟等水稻鳞翅目害虫；所用的标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因hph，提供对潮霉素B的抗性。目的基因和标记基因是经基因枪介导的双质粒共转化法导入受体品种的，由于发生了独立整合，使抗潮霉素的标记基因因自交分离而未遗传给华恢1号。
分子特征分析表明，整合到华恢1号的插入序列的全长为9.818kb，其整合位点位于水稻第10染色体第5354669至5354670碱基之间。插入序列包含一个完整和一个不完整的cry1Ab/Ac融合蛋白基因以及一个不完整的来源于载体序列的抗氨苄霉素标记基因（AmpR）片段。由于比完整的AmpR基因少了208bp，且没有启动子，因此，该片段并不能转录为相应的mRNA和表达相应的蛋白，且被表达检测试验所证实。
遗传稳定性分析表明，插入序列服从孟德尔单位点的遗传规律，且目的基因能在根、茎、叶、花、种子等组织器官中稳定地表达。在叶片中检测的表达量为可溶性蛋白质的0.01%。自华恢1号选育以来，在近10年的种植过程中，从未观察到插入的外源目的基因cry1Ab/Ac发生基因沉默的现象。
田间观察和环境安全性试验分析表明，Bt汕优63高抗稻纵卷叶螟、二化螟、三化螟等水稻鳞翅目害虫；Bt汕优63与汕优63相比，在生存竞争能力、向野生稻和杂草稻发生基因漂流可能形成的环境影响、对稻飞虱等非靶标害虫的影响、对稻田蜘蛛等天敌和有益昆虫的影响、对稻田节肢动物多样性等的影响方面，其环境安全性水平没有发现明显的改变，对农田生态和环境产生不良影响的可能性小。
食用安全性分析表明，华恢1号稻米关键营养成分和抗营养因子具有与传统大米等同的营养价值；用Cry1Ab/Ac蛋白经口灌胃小鼠和经90天喂养含高、中、低剂量华恢1号稻谷的大鼠未观察到生长异常；Cry1Ab/Ac蛋白在体外模拟胃肠液中易消化，其氨基酸序列与已知过敏原的氨基酸序列无同源性，潜在过敏性低。现有数据还表明，华恢1号稻米对农药、重金属没有富集作用。综合分析认为，华恢1号所配杂交组合Bt汕优63对哺乳动物和人体健康不会产生不良影响。
二、受体生物学特性
此报告涉及的受体生物为水稻，在分类上属于单子叶植物纲颖花目禾本科(Gramineae) 稻属(Oryza)。水稻栽培种有2个，即普通栽培稻(Oryza sativaL)或称亚洲栽培稻和非洲栽培稻(0ryza glaberrimaSteud)。普通栽培稻主要分布于亚洲，在世界各地都有种植，非洲栽培稻仅在西非有少量栽培。水稻的野生近缘种有20～25个，其中，在中国境内发现的有三种，即普通野生稻（Oryza nivaraL.）、药用野生稻（Oryza officinalis L.）和疣粒野生稻（Oryza minuta L.）。尽管普通野生稻在我国的地域分布上可南起海南三亚（18°09´N），北至江西东乡（28°14´N）,西起云南盈江（97°56´E），东至台湾桃园（121°15´E），但各地均只有零星生长。一般认为，普通栽培稻是由普通野生稻进化而来，因此，两者的亲缘关系近、异交结实率较高。
中国是世界水稻生产大国，常年水稻种植面积约占粮食作物播种面积的1/3，占世界水稻面积的20%，居世界第二；年度稻谷总产量约占我国粮食总产量的41%，占世界稻谷总产的31%，居世界第一。
Bt汕优63是基于优势杂交组合汕优63（珍汕97A/明恢63）通过转基因改良的抗虫杂交水稻。汕优63是福建省三明市农业科学研究所于1981年育成，该组合属于迟熟中籼类型。汕优63典型的农艺特征为：株高110厘米左右，株形适中，叶片稍宽，剑叶挺直，叶色较淡，茎秆粗壮，分蘖力较强，每公顷有效穗270万穗，每穗120－130粒，结实率80%以上，千粒重29克，抗稻瘟病，中抗白叶枯病和稻飞虱。该组合具有良好的株叶形态、丰产性和抗性，作中稻一般每公顷产量为7500千克，高产者可达8250千克以上，曾经是我国杂交水稻种植面积发展最快、种植面积最大的组合之一。
三、基因操作
此报告涉及的转基因植物为Bt汕优63。Bt汕优63是转基因抗虫恢复系华恢1号和不育系珍汕97A所配的杂交组合。华恢1号的原始转化事件为TT51，通过自交分离获得的等同于华恢1号的无标记基因株系为TT51-1。
基因操作所用的受体品种是汕优63的恢复系明恢63；所用的目的基因是由中国农科院生物工程中心范云六院士等人工合成的cry1Ab/Ac融合蛋白基因，cry1Ab/Ac的表达产物能够专一而且有效地控制水稻二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟等水稻鳞翅目害虫。所用的标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因hph，提供对潮霉素B的抗性。目的基因和标记基因是经基因枪介导的双质粒共转化法导入受体品种的，由于发生了独立整合，使抗潮霉素标记基因因自交分离而未遗传给华恢1号。
用于华恢1号转化的cry1Ab/Ac融合蛋白基因的功能表达单位主要由三部分组成：包括包含第一外显子和第一内含子在内的水稻actin I启动子、cry1Ab/Ac编码序列和人工合成的农杆菌胭脂碱合成酶基因（nos）终止子。该功能表达单位的结构示意图和各元件的大小如图1所示。
图1 cry1Ab/Ac融合蛋白基因的功能表达单位。图中箭头所示为转录方向。
回交转育和遗传分析表明，插入序列服从单位点的孟德尔遗传，且能通过花粉传递。这表明外源的cry1Ab/Ac基因已稳定地整合到核基因组中。
另外，插入的cry1Ab/Ac基因在华恢1号中的表达不具有组织和发育特异性，稻株的各器官，如根、茎、叶、花、种子等均能稳定表达Cry1Ab/Ac融合蛋白。在叶片中检测到的与期望分子量大小（60kDa）一致的有效表达量约占可溶性蛋白质的0.01%。
四、遗传稳定性
目的基因整合的稳定性。在回交转育过程中观察到，华恢1号中整合的cry1Ab/Ac基因与其它核基因一样可以通过花粉传递，且在回交1代群体中呈现单位点孟德尔遗传，表明外源cry1Ab/Ac基因已稳定地整合到核基因组中。
目的基因表达的稳定性。研究表明插入的cry1Ab/Ac基因在华恢1号中的表达不具有组织和发育特异性，稻株的各器官，如根、茎、叶、花、种子等均能稳定表达Cry1Ab/Ac融合蛋白。自华恢1号选育以来，在近10年的试验过程中，从未观察到插入的外源目的基因cry1Ab/Ac发生基因沉默的现象。
2000年，Western杂交分析表明华恢1号叶片中Cry1Ab/Ac的有效表达量约占可溶性蛋白质的0.01%。2008年ELISA 分析证实目的基因在不同生态点（荆州、福州和宣城）和不同生长时期（分蘖期、拔节期、齐穗期和成熟期）采样的根、茎、叶、颍果等4种组织器官中均有表达，其平均表达量分别为0.25~0.92 、1.26~1.83、1.88~2.36和1.58~1.85μg/g。
目标性状表现的稳定性。自华恢1号选育以来，其所配组合Bt汕优63先后进行了中间试验、环境释放试验、大田生产性试验。各阶段的试验结果均表明汕优63无论是对人工大虫量接种的三化螟一龄幼虫（2卵块/株）还是对自然发生的二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫均有显著而且稳定的抗性。与汕优63对照相比，Bt汕优63对二化螟、三化螟的抗虫效果达90％以上；对稻纵卷叶螟的抗虫效果达80％以上。
2007～2008年，第三方检测验证试验在湖北荆州、福建福州和安徽宣城进行，结果表明，Bt汕优63对主要水稻鳞翅目钻蛀害虫螟虫（二化螟、三化螟）和稻纵卷叶螟的抗性显著，田间控制效果分别为88%～100%、81%～100%；对次要鳞翅目害虫稻苞虫亦有明显的抗虫效果。
五、环境安全评价
1、生存竞争能力
与对照汕优63相比，Bt汕优63的主要农艺性状如株型、株高、生育期、结实率、产量和适应性等均无明显变化。另外，Bt汕优63在有性繁殖特性、授粉方式、异交结实率和花粉的离体生存和传播能力、休眠性、落粒性和越冬能力等方面均无明显的改变。
在抗病虫方面，Bt汕优63除对鳞翅目害虫有显著的抗性外，对稻飞虱等非靶标害虫、对稻田蜘蛛等天敌和有益昆虫、对稻田节肢动物等的多样性方面，其环境安全性水平没有发生明显的变化；对水稻的主要病害包括水稻纹枯病、稻曲病、稻瘟病和白叶枯病等的发生也未见有差异。
汕优63是我国长江流域及以南区域种植的一种籼稻三系杂交组合。在自然条件下，籼稻与同种或近缘野生种的天然异交率一致，通常为0.2～4％，但与在中国分布的三种野生稻之间的杂种不育。栽培稻与杂草稻之间的异交率也低于0.3%。因此，Bt汕优63的抗虫基因通过天然异交途径逃逸到野生近缘属种的可能性较小。
2、基因漂移
水稻是典型的自花授粉作物，散出的花粉虽然可借助风媒传播，但由于在空气中的存活时间一般仅为5min，极个别情况下可达15 min），因而，大大限制了其远距离传播的可能性。
外源基因向非转基因栽培稻漂流的可能性。系统研究数据表明，在相邻种植的条件下，转基因向籼粳稻常规品种和杂交品种的基因漂流频率均在1%以下，向中9A、博A、泗稻8A等不育系的基因漂流频率可达30～90%，向异交结实率低的培矮64S等不育系的基因漂流频率<10%。基因漂流频率随距离增加而呈指数下降，并与风速、风向有关。另外，水稻基因漂流的最大距离因不同受体材料而异，常规稻和杂交稻品种为1～100 m，不育系为4～320 m。花期隔离可有效降低基因漂流频率至零。
外源转基因向野生稻漂流的可能性。在我国生长的药用野生稻O. officinalis（CC基因组）和疣粒野生稻O. minuta（GG基因组）因其基因组与栽培稻不同，彼此间的杂交不育，因而阻断了外源转基因向这两种野生稻漂流的可能性。在自然环境中多年生普通野生稻Oryza nivara（AA基因组）接受明恢63基因流的频率＜3%（卢宝荣等，2003）。栽培稻花粉散布距离是有限的，当风速为10m／s（约为5级风）时，栽培稻花粉的最大传播距离为110m（卢宝荣等，2003）。因此，在转基因稻和其野生近缘种之间采取大于110m的空间隔离，或利用其他高秆作物设立隔离带，便能有效地避免转基因稻的外源基因向野生稻漂移（卢宝荣等，2003）。
外源转基因向禾本科杂草漂流的可能性。贾士荣等（2007）曾连续5年采集与种植转基因抗Basta除草剂水稻长期共生的稗草种子，播种出苗后，自三叶期起先后喷施500、500、800 ppm 的Basta溶液3次，结果总共5万多株稗草幼苗全部死亡；宋小玲等（2002）人工地将转基因花粉授在稗草柱头上，但因花粉粒不萌发或花粉管停止生长，杂交结实率为零。这些数据说明转基因水稻向稗草的基因漂流频率为零。
属内种间和种内亚种及品种间的基因漂流历来存在，它是植物进化的动力。基因漂流本身并不等于环境风险，而是它可能引起的环境风险。这往往取决于基因的种类、基因所提供的性状、以及转基因植物释放的环境。目前，并没有任何确切的数据表明来源于苏云金芽胞杆菌的cry1类杀虫蛋白在农业生产中的直接（作为生物农药）和间接（通过转基因）应用对环境安全有不良影响。
外源转基因向其他物种漂流的可能性。目前已有的实验数据都不能证明外源转基因可由植物向动物和微生物发生水平转移(Schlüter et al.,1995;Nielsen et al.,1998;Bertolla and Simonet,1999;Gebhard and Smalla,1999)。
3、对靶标和非靶标生物的影响
田间观察和环境安全性试验分析表明，Bt汕优63高抗稻纵卷叶螟、二化螟、三化螟等水稻鳞翅目害虫。与汕优63相比，Bt汕优63对稻飞虱等非靶标害虫的影响、对稻田蜘蛛等天敌和有益昆虫的影响、对稻田节肢动物生物多样性的影响等方面，其环境安全性水平没有差异，对农田生态和环境产生不良影响的可能性小。
六、食用安全评价
1、营养学评价
2007年对在福建、湖北和安徽三地种植的华恢1号与对照明恢63进行了营养成分的检测，包括主要成分（水分、灰分、蛋白质、脂肪、淀粉）、微量营养成分（氨基酸、脂肪酸、矿物质、维生素）以及抗营养因子（胰蛋白酶抑制剂和植酸）。结果表明，华恢1号的主要营养成分和抗营养因子与对照明恢63相比，没有生物学意义上的差异。
2、毒理学评价
对原核表达及水稻来源的Cry1Ab/Ac蛋白的表观分子量、免疫原性、糖基化和生物活性测定的结果表明，两种来源的Cry1Ab/Ac蛋白具有实质等同性。在此基础上，对原核表达的Cry1Ab/Ac蛋白进行了急性毒性试验，结果表明，该蛋白的LD50≥5 g/kg•bw。根据毒性分级，该蛋白属实际无毒。
用华恢1号稻米喂养大鼠90天后，与明恢63相比，未发现转基因稻米对大鼠的体重、食物利用率、血液学和血生化指标、脏器系数、病理学变化等指标产生不利影响。华恢1号稻谷的短期喂养试验、遗传毒性试验、三代繁殖试验、慢性毒性试验结果表明，转基因稻谷对受试动物以及它们后代的胚胎没有急性、进行性或不可逆性毒性和致畸、致癌作用。
动物试验的结果说明华恢1号转基因水稻对人类的健康具有潜在不良影响的可能性很小。因此，其所配组合Bt汕优63对人类健康具有潜在不良影响的可能性也同样很小。
3、致敏性评价
人类认识Bt蛋白的来源生物苏云金芽胞杆菌的历史已有百年，使用Bt制剂作为生物杀虫剂的安全使用记录已有70多年，大规模种植和应用Bt作物已经超过10年。其间没有苏云金芽胞杆菌及其蛋白引起过敏反应的报告，也没有与生产含有苏云金芽胞杆菌的产品有关的职业性过敏反应的纪录。以上资料表明，Cry1Ab/Ac蛋白没有引起过敏反应的证据。
对Cry1Ab/Ac蛋白与已知致敏原的氨基酸序列同源性进行比较的结果显示，Cry1Ab/Ac蛋白与已知致敏原无序列相似性。
对Cry1Ab/Ac蛋白进行的体外模拟胃肠道消化试验的结果显示，该蛋白在模拟胃液与模拟肠液中于15S内迅速降解，不具有消化稳定性。
综上所述，转基因水稻华恢1号中的Cry1Ab/Ac蛋白具有引起过敏反应的可能性很小。因此，其所配组合Bt汕优63中的Cry1Ab/Ac蛋白具有引起过敏反应的可能性也很小。
4、抗生素抗性
华恢1号选育过程中，潮霉素抗性标记基因（hph）已通过自交重组的方法从基因组中剔除；基因组中有部分氨苄青霉素抗性基因序列，但缺少启动子及其编码序列5’端的208个碱基，该片段不具有转录和翻译功能。因此，华恢1号所配组合Bt汕优63不存在潮霉素和氨苄青霉素耐药性问题。
5、重金属与农药残留
2007年对三地取样的华恢1号及明恢63的有毒重金属（汞、硒、铅、镉、砷）和农药残留的检测，未发现华恢1号对重金属有富集作用，其农药残留与对照明恢63相比也没有差异。华恢1号水稻对重金属和农药无富集作用。因此，其所配组合Bt汕优63也对重金属和农药无富集作用。
八、非预期效应
分子分析结果显示，华恢1号基因组中除了整合有2拷贝外源目的基因cry1Ab/Ac基因外，还整合有部分载体序列，其中包含一段不完全整合的抗氨苄青霉素标记基因的编码序列。但由于它缺失了从起始密码子至中间的长度为208bp的片段，且没有启动子序列，经RT-PCR和Northern分析证实该不完全序列并不能转录mRNA。
在华恢1号基因组中，目的基因表达后引起华恢1号的叶色变淡，株高轻微增高和生育期略微延长等非预期效应。但是，这些非预期效应没有出现在Bt汕优63中。与汕优63相比，Bt汕优63的叶色正常。主要农艺性状包括株高、产量、生育期、适应性、有性繁殖特性、授粉方式、异交结实率、花粉的离体生存和传播能力、休眠性、落粒性和越冬能力等方面也没有发现明显的改变。
九、生产应用前景及拟采取的安全监控措施
无标记基因的转基因抗虫恢复系华恢1号自1998年培育出来后，华恢1号和Bt汕优63从1999至今先后在湖北、安徽、江西、湖南和福建等省区进行了多年、多点、多次的中间试验、环境释放实验、生产性试验以及第三方检测验证试验，完成了分子特征分析、遗传稳定性评价、环境安全和食用安全评价等一系列试验，获得了插入位点和插入序列及其遗传与表达稳定性的准确数据。所有的田间观测结果均一致地表明华恢1号及Bt汕优63对二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟等水稻鳞翅目靶标害虫的抗性显著；Bt汕优63与汕优63相比，其环境安全性水平没有发现明显的变化，对哺乳动物和人类健康不会产生不良影响。这为Bt汕优63在生产上的应用奠定了坚实的理论基础。
华恢1号的受体品种明恢63及其所配杂交组合汕优63，历史上曾是是我国三系杂交稻组合中单产最高、推广面积最大的一个杂交稻品种。品种年度推广面积曾高达700万公顷以上。然而，象所有其它水稻品种或组合一样，其巨大的生产潜力往往因水稻害虫尤其是螟虫等鳞翅目害虫的危害而出现较大的波动，导致高产而不稳产。另外，化学防治虽然是过去几十年里人们一直沿用的方法，但其高成本、高残毒和相对的低效用愈来愈为人们所关注。转基因抗虫恢复系华恢1号及其杂交组合Bt汕优63的培育正是为了改进杂交组合汕优63的抗鳞翅目害虫性能而研制的。由于高效抗虫，它能有效地改善其所配杂交组合的丰产和稳产性能，减少农药使用量，节约生产成本，从而使农民能真正增产增收。因而，它的推广应用前景无疑将是十分广阔的。
为了积极配合Bt汕优63的推广应用，将拟订采取如下安全监控措施：
1. 实行严格的种子登记制度，禁止个人的种子买卖行为；在没有得到国家批准前，严防种子流入临近省份，特别是南方有野生稻分布的省份；
2. 积极开发、选育新的抗虫品种，包括使用不同的抗虫基因，以防遗传背景过分单一招致严重的因抗虫性丧失而造成严重损失的后果；
3. 对品种释放地进行严密跟踪观察，及时发现问题及时解决；同时，与推广区的县、乡、镇和农户保持良好的沟通渠道，并为他们提供及时的技术指导，以使Bt汕优63得到正确的利用和种植。
4. 加强对害虫产生抗虫性的研究、监控与监测。
