武汉病毒所提出耐药病原微生物快速检测新策略

中国科学院武汉病毒研究所危宏平研究团队提出了一种基于PCR及蛋白质体外快速表达与功能变化测定的耐药性快速检测新策略(GPF策略)，并成功用于多种病原微生物的耐药性快速检测，三篇相关研究论文发表在临床微生物检测杂志Journal of Clinical Microbiology上。

由于病原微生物耐药性日益严重，2011年的世界卫生日提出了“现在不采取行动，明天就无药可用”的主题来呼吁高度重视细菌耐药性问题。快速检测耐药性，将能为临床治疗提供有效及时的指导以及防止病原菌产生新的耐药性。危宏平研究团队为了解决目前微生物耐药性检测标准法(培养法)存在的需要菌分离、时间长等技术难题，提出了一种结合PCR及体外快速表达蛋白质、通过蛋白质功能变化测定耐药性的新策略(GPF策略)，并进一步结合实时定量PCR方法，实现了致病微生物及其耐药性的联合快速检测，并成功用于了多种目前很难测定的耐药性的快速检测。

该研究团队基于GPF策略设计了结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测新方法。该方法不依赖测定具体的突变位点，直接通过体外快速表达的吡嗪酰胺酶的功能变化来测定耐药性，有效解决了结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性快速检测这一挑战性难题。并进一步结合实时定量PCR方法，实现了在2小时内检测痰液中结核分枝杆菌及1天内测定其吡嗪酰胺耐药性。结果通过颜色变化就可以判读，不需要复杂仪器，成本较低，可在基层医院临床实验室使用。该研究结果发表于J. Clin. Microbiol., 2014, 52(1), 260-267。

该团队还建立了临床血清中丙肝病毒(HCV)对蛋白酶抑制剂耐药性的快速检测新方法，解决了由于HCV的RNA复制酶不具有保真功能，通过基因突变规律来检测耐药性非常困难的问题。通过将HCV NS3基因从样本中扩增出来并体外快速转录成蛋白酶，实现了在10小时内完成HCV对两种美国FDA批准的Telaprevir以及Boceprevir药物的耐药性检测，为HCV病毒耐药性快速检测提供了一种新的模式。研究结果发表于J. Clin. Microbiol., 2014, 52(4): 1139-1145。

该团队进一步采用GPF策略，建立了一种1小时内检测NDM-1基因及1天内测定其功能突变体的快速方法，为NDM-1这一重要耐药基因的快速检测和流行变化，提供了一种新的快速检测手段。新德里金属β-内酰胺酶(NDM-1)耐药基因是2009年从印度分离的一种新耐药基因，由于带有该基因的菌对碳青霉烯类抗生素的广泛耐药性，带有该基因的菌被称为超级耐药细菌，已被WHO认为是一种全球性的威胁。在NDM-1的传播过程中，一些新的带有更强水解碳青霉烯类抗生素的突变体也被陆续报道，目前已有10种NDM突变体报道。但目前用于发现NDM功能突变体的主要方法是测序和重组表达，时间长（几周）、成本高，不利于及时监测NDM-1的流行规律。研究结果已被J. Clin. Microbiol.接受，将发表在2014年6月的期刊上。

以上这些结果说明了危宏平研究团队提出的GPF策略具有很好的适用性，其显著特点在于克服了目前通过测定基因突变位点来测定耐药性的局限性，为生长缓慢的细菌和为无基因突变热点的耐药性检测提供了一条新的技术途径，应用前景十分广阔。