分子植物育种 － 2014年第12卷第3期目录

大麻为大麻科大麻属1~2 年生雌雄异株草本植物，是包括中国在内的许多国家的重要经济作物。由于大麻花叶部分含有四氢大麻酚(THC)这一具有强烈成瘾性和麻醉性的毒性成分，因而成为主要的毒品源之一，因此，大麻植株的鉴定对于打击贩毒及相关刑事案件的审定具有重要的意义。传统的分子生物学鉴定使用的大麻遗传标记有随机扩增多态性DNA (RAPD)和扩增片段长度多态性(AFLP)等，但它们易受环境条件的影响，重复性和稳定性差，仅适用大麻研究中引物的初筛。本文综述了近年来新发现的大麻遗传标记，如序列特异性扩增区(SCAR)、叶绿体基因组(cpDNA)上的特定基因位点、短串联重复序列(STR)、单核苷酸多态性(SNP)的特性以及研究进展，并探讨它们在大麻育种、法庭科学、大麻系统进化等方面的应用前景，旨在为法庭科学和农业育种学等相关学科的应用和研究提供参考。

植物在生长发育过程中容易遭受到各种各样生物胁迫因子的影响。蛋白质组学技术通过挖掘各种生物逆境条件下差异变化的蛋白和基因，在植物抗逆生理机制研究方面发挥了重要作用。本文综述了国际上在植物生物逆境蛋白质组研究方面的最新进展，总结植物生物逆境蛋白质组研究的常用方法，分析各种主要植物在各种生物逆境胁迫下的蛋白应答情况，展望了蛋白质组学结合转基因技术在植物保护领域的进一步应用。

蛋白质磷酸化修饰是调控多样种生物过程的一种重要的翻译后修饰，定量分析内部和外部因子作用下磷酸化蛋白质的分子调控机制对理解生物功能非常重要。早期磷酸化蛋白质组研究的重点是定性检测、鉴定磷酸化蛋白质及磷酸化位点的定位。近年来，随着质谱技术的快速发展使得定量磷酸化蛋白质组研究有了很大的发展。利用磷酸化蛋白质组的定量分析监测蛋白质磷酸化的动态变化有助于阐明生物过程及其功能的实现机制。本文综述了磷酸化蛋白质组定量分析策略：基于2-DE 的磷酸化蛋白质组定量策略，基于无胶的质谱磷酸化蛋白质组标记定量策略及无标记定量分析策略。磷酸化蛋白质组的定量分析将有助于更好的阐明生物的信号传导机制。

紫肉甘薯中的花青苷有较强的抗氧化能力，在医疗保健和工业生产上发挥着重要作用，受到越来越多消费者的青睐。本文综述了近几年紫肉甘薯块根花青苷合成调控的研究进展，并对影响甘薯花青苷生物合成与积累的众多因素进行探讨，主要包括花青苷生物合成的相关酶基因苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮3- 羟化酶(F3H)、二羟基黄酮醇还原酶(DFR)、花青苷合成酶(ANS)以及类黄酮3-O- 糖基转移酶(UFGT)、转录调控因子(MYB, bHLH 和WD40)、MicroRNA 和可溶性糖，以及光照、温度、钾元素等重要环境因子。归纳分析发现，甘薯花青苷的合成和积累与相关酶基因和转录因子的表达有直接的关系，MicroRNA 活性、可溶性糖、光、温度、钾元素等通过不同调控机制以促进花青苷的合成。通过对这些影响甘薯花青苷合成途径内外因子的分析和汇总，可以明确甘薯花青苷代谢机制，为紫甘薯品质育种提供思路和方向。

为了探究茶树叶绿体DNA (chloroplast DNA, cpDNA)的提取方法，本研究采用改进的高盐- 低pH法和Percoll 密度梯度法提取cpDNA。结果表明，两种方法提取的cpDNA 经分光光度计检测，A260/A280 值在1.80~1.90，高盐- 低pH 法提取的cpDNA 产率为0.65 μg/g，Percoll 密度梯度法提取的cpDNA 产率为0.07 μg/g。提取的cpDNA 经PCR 检测，均能扩增出目标片段，但高盐- 低pH 法效果更好。研究结果为进一步研究茶树叶绿体基因组结构、功能等方面奠定基础。

云杉(Picea)是一种重要的绿化和用材树种。根据云杉的特点，本研究提出了改良的云杉RNA 提取方法即SDS 酚-LiCl 法，以不同种云杉(青杄, 白杄和红皮)的针叶为试验材料，采用TRIzol 法、CTAB 法、改进的SDS 酚法和SDS 酚-LiCl 法提取RNA，并进行了质量验证。结果表明：TRIzol 法不能提取云杉针叶总RNA；CTAB 法和改进的SDS 酚法提取的RNA 质量少，并存在不同程度的多糖、多酚和DNA 污染。SDS 酚-LiCl法适当增加了提取液中SDS、PVP 以及茁- 巯基乙醇的浓度，结合酸性条件、高盐溶液(3 mol/L NaAc)和LiCl等减少DNA、多糖污染的步骤，最终提取的RNA 质量好、得率高。进一步反转录后，利用特异引物进行扩增验证，发现扩增的片段条带清晰，得率高，片段大小符合预期。研究结果表明，SDS 酚-LiCl 法可以较好的提取云杉RNA 并进行后续的基因表达及转录组研究，为推动云杉在转录水平上的研究奠定了基础。

不同的水稻品种对外界低温胁迫的反应不同，弄清水稻的耐冷机制对水稻的生产至关重要。位于云南红河州元阳梯田的地方水稻品种经过长期的驯化，其产量不随着当地海拔的升高而发生变化，具有很好的生态适应性。本研究拟以元阳传统水稻品种“月亮古”为材料，研究其受到不同的低温胁迫时的响应机制。研究表明，以常温(28℃ (06:00—18:00)/25℃ (18:00—06:00))为对照，对该水稻品种采用低温1 (20℃(06:00 —18:00)/12℃ (18:00—06:00))和低温2 (18℃ (06:00—18:00)/5℃ (18:00—06:00))处理后，抗氧化酶系统活性如过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽还原酶(GR)、超氧化物歧化酶(SOD)均出现一定程度的升高，只是低温2 处理后，保护酶升高和降低的程度要更剧烈。花粉育性检测证实，在传统品种受到低温1 的处理时，其花粉育性受到的影响很小，而低温2 处理后，花粉育性受到的影响很大；同时，叶绿素荧光参数Fv/Fm 的测定显示适当的低温处理对该传统品种的影响较小，而剧烈的低温处理对该传统品种的影响很大。试验结果表明传统水稻品种对温和的温度梯度变化具备很好的适应性。

本研究以项目组选育的3 个紫花含笑新品种“荷瓣墨紫”、“蝶瓣墨紫”和“梅瓣墨紫”为对象，建立了基于ISSR 标记的分子鉴别体系。3 个UBC 系列ISSR 标记的扩增产物UBC815-1 000 bp、UBC836-1 200 bp及UBC840-460 bp，可有效鉴别“荷瓣墨紫”、“梅瓣墨紫”和“蝶瓣墨紫”3 个新品种；根据UBC844 扩增的谱带，可将3 个新品种与紫花含笑其它个体区分开来；根据UBC854-1 100 bp 标记，可一次性将紫花含笑从含笑、乐昌含笑、深山含笑和金叶含笑4 个近缘种中区别出来。ISSR 检测结果还表明，含笑属5 个种的物种水平的Nei's 基因多样度(h)为0.312 3，Shannon 信息指数(I)为0.471 2，显示物种间具有丰富的遗传多样性。5个种种间的Nei 遗传距离在0.169 3~0.778 7 之间，相似系数在0.483 6~0.786 9 之间。采用UPGMA 聚类法以遗传距离进行聚类，结果表明：含笑属5 个种中，同种的不同个体均能很好地聚在同一种下，显示在分子水平上支持5 个种的传统分类方法；分析5 个种的亲缘关系，紫花含笑与含笑的亲缘关系最近，而与乐昌含笑的亲缘关系最远，这与前两物种在表型上更为接近相一致。本研究可为紫花含笑杂交育种亲本的选配、嫁接繁殖砧木的选择和种(或品种)的鉴别等提供重要依据。

利用具有多态性的31对SSR引物，对国内外191份不结球白菜的遗传多样性及亲缘关系进行了分析。引物平均多态性信息含量(PIC)为0.34；供试不结球白菜品种(系)的平均期望杂合度(He)为0.41，Shannon's信息指数(I)为0.65；遗传分化系数(Gst)为0.20，说明80﹪的遗传多样性来自品种(系)之间的差异。不同生态区域的遗传多样性具有差异: 国内高于国外，且江淮流域最高。利用UPGMA法作图，将供试的191份品种(系)聚为六大类，同时Structure种质遗传结构分组结果与UPGMA法聚类结果基本吻合，两种分析方法均说明了类群划分与地理分布有一定相关性。结果表明不结球白菜品种(系)具有丰富的遗传多样性，大部分品种(系)的亲缘关系聚类是按照地理来源及种质遗传背景进行，本研究为不结球白菜育种研究提供了参考。

为研究SSR 分子标记辅助提纯选育棉花新品种的可行性，本研究利用SSR 分子标记对402系×33系杂交获得的F5高代材料进行分子标记辅助提纯选育分析，并通过前期已筛选的亲本具有多态性的4对SSR分子标记对F5群体、常规提纯选育F6（CKF6）群体及分子标记辅助提纯后F6（MASF6）群体进行遗传分析。结果表明： F5群体遗传相似系数在0.28~1.0之间，纯度为47%；CKF6群体遗传相似系数在0.57~1.0之间，纯度为58.75%，而MASF6群体带型完全一致；在农艺性状相同的情况下，利用SSR分子标记筛选的MASF6相对于CKF6在这些位点的纯合度提高了1.7倍。研究结果说明利用分子标记辅助提纯选育棉花是一项有效可行的方法。

表观遗传变异是体细胞无性系变异产生的重要基础。为研究红掌体细胞突变过程中DNA 甲基化的变异，本研究采用MSAP (methylation-sensitive amplification polymorphism)技术对红掌品种‘阿拉巴马’(Anthurium andraeanum Lind.‘Alabama’)正常株及白色佛焰苞变异株基因组胞嘧啶的甲基化模式进行了比较和分析。121 对引物共扩增出5 109 条带，红掌正常株和变异株基因组中分别检测到1 834 和1 859 个位点的DNA 胞嘧啶发生甲基化，甲基化率为36.37%和36.70%，其中，胞嘧啶内侧全甲基化的发生频率高于外侧半甲基化。正常株与变异株间有209 个位点(4.09%)的甲基化状态存在变异，主要分为4 组变化类型，变异模式以重新甲基化和完全去甲基化为主，分别占多态性甲基化位点的34.45%和31.58%。研究结果显示，红掌‘阿拉巴马’正常株与变异株间基因组胞嘧啶甲基化状态存在较大差异，组织培养过程中产生的佛焰苞表型的变异可能与其基因组甲基化模式的改变有关。

通过改良的RACE 技术从花生中分离并克隆出ADH 全长cDNA 序列，并命名为AhADH，其全长为1 155 bp，含一个编码269 个氨基酸，长度为810 bp 的开放阅读框。生物信息学分析显示AhADH 蛋白的分子质量是30.65 kD，理论等电点是6.07，二级结构主要由α- 螺旋和无规卷曲组成。序列比对表明花生ADH 氨基酸序列含预苯酸/ 预苯胺酸脱氢酶结构域，且与多种其他植物的ADH 具有高度同源性。qRT-PCR分析表明该基因具有组织表达差异性，且在茎中表达量最高。

本研究为了进一步分析实验室前期利用RACE技术从洋葱花蕾中分离到的AcPI基因的功能，构建了AcPI基因的过表达载体，采用冻融法将表达载体转入农杆菌菌株LBA4404后，通过花序侵染法介导转化生态型拟南芥进行过表达试验。转基因植株的PCR和RT-PCR分析结果表明，外源基因AcPI已经整合到拟南芥基因组中并在转录水平上表达；转AcPI基因植株除了开花时间比野生型植株有所提前外，花器官和营养器官在形态上均未发生明显改变。因此，AcPI基因的功能需要进一步利用RNAi干涉技术进行研究，以为今后全面剖析洋葱花器官发育的分子遗传机制及利用生物工程技术创造洋葱雄性不育植株提供理论依据。

根据二倍体野生森林草莓(Fragaria vesca)预测的bHLH78-like 基因序列设计特异性引物，利用RT-PCR 技术从八倍体栽培凤梨草莓(Fragaria伊ananassa)品种‘幸香’果实中克隆出FabHLH78 基因全长CDS。测序和分析结果表明，FabHLH78 基因的CDS 全长1 653 bp，编码550 个氨基酸残基，在线软件Compute pI/Mw 分析编码的蛋白质理论分子量约为59.6 kD、等电点(pI) 6.17，经软件DNAMAN 分析，核酸序列和氨基酸序列与二倍体草莓FvbHLH78-like 基因的一致性分别为98.31%和96.55%。利用半定量PCR检测FabHLH78 基因在草莓根、匍匐茎、叶、果实中的表达情况，发现其只在果实中特异表达；实时定量RT-PCR 结果显示随着果实发育FabHLH78 基因表达量逐渐增加。FabHLH78 全长CDS 被整合到植物表达载体pRI101-AN 上，构建出FabHLH78 基因的过量表达载体pRI101-bHLH78，为进一步验证FabHLH78 基因的功能奠定了基础。

为了研究凤梨科植物开花的机理，本研究利用5'RACE和3'RACE方法从蜻蜓凤梨中克隆得到响应开花的主要调控基因FT1。该基因CDS序列全长为625 bp。为了进一步研究其功能，本研究将其重组并构建了以CaMV35S为启动子、GUS为报告基因的植物表达载体CaMV35S-GUS-FT1，并采用农杆菌介导的方法转化云烟K346烟草的幼嫩叶片，经GUS组织化学染色观察转基因烟草体细胞中GUS报告基因的表达情况。研究结果验证了重组构建的FT1基因载体的正确性，为进一步解析FT1基因在蜻蜓凤梨开花过程中的功能奠定了基础。

木薯是全球三大薯类作物之一，具有抗逆、耐瘠的特性。气态植物激素乙烯在植物生长发育和应对生物及非生物胁迫过程中起着重要作用。本研究收集了木薯乙烯信号途径中的受体基因家族(MeERS1, MeERS2, MeERS3, MeERS4, MeERS5, MeETR2和MeEIN4)和部分转录因子基因家族(MeEIL1, MeEIL2)，通过生物信息学方法对这些基因进行了多重比对、保守结构域预测和聚类分析，并采用实时荧光定量PCR的方法测定它们在木薯华南五号不同组织器官中的转录表达水平。生物信息学分析结果表明，受体蛋白都含有高度保守的GAF和HisKA结构域，而转录因子则含有EIN3结构域。另外，受体蛋白都具有跨膜结构域，有的还具有信号肽，而转录因子不具有这些结构域。转录表达分析结果表明，MeERS1、MeERS3、MeEIN4和MeEIL2成组成型表达，在茎、根、块根和叶中没有明显的表达差异；而另一部分基因则成组织器官差异型表达，其中MeERS2和MeETR2主要在茎和叶中高表达，MaERS4、MaERS5和MaEIL1主要在根、茎和叶中表达，在块根中表达量较低。这些结果将为进一步研究乙烯信号途径在木薯抗胁迫过程中的功能奠定基础。

木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶(XTH)是一类庞大的多基因家族，在细胞壁形成以及植物生长发育过程中起重要作用。本研究利用同源序列设计引物进行PCR扩增，克隆得到甘蓝型油菜XTH基因的cDNA序列，将其命名为BnXTH1 (GenBank登录号: KF612342)。BnXTH1的开放阅读框长855 bp，编码284个氨基酸，预测的蛋白质相对分子质量为32.46 kD，等电点为8.84，含有典型的XTH蛋白催化活性序列DEIDFEFLGN。系统进化分析表明该基因与拟南芥XTH17进化关系最近。半定量RT-PCR分析结果显示，BnXTH1在花和根中表达量较高，其在幼苗中的表达受赤霉素、油菜素内酯以及生长素的诱导，推测该基因可能与幼苗生长发育的调控有关。

本研究以单株马尾松的142个大配子体为作图群体，利用筛选的55对SSR引物和 142对SRAP引物获得502个标记，构建了一张包含237个标记、 18个连锁群的马尾松遗传连锁图谱。马尾松连锁图谱总图距为1 462.1 cM，最大连锁群图距为136.4 cM，最小连锁群图距为36.7 cM，平均每个连锁群长度为81.2 cM，标记之间平均图距为6.2 cM。此外，利用 L16(45)正交试验表对影响PCR结果的Mg2+、 dNTP、模板DNA、引物浓度、Taq DNA聚合酶进行试验，建立了适合马尾松SSR-PCR和SRAP-PCR的反应体系。

单染色体片段代换系是QTL精细定位的理想材料。水稻对细菌性条斑病的抗性属于典型的数量抗性。本研究以课题组构建的携有多个细条病抗性QTL (qBlsr3d, qBlsr5a和qBlsr5b)的近等基因系H359R为供体亲本，以感病品种H359为受体亲本，通过杂交，多次回交和自交，并结合分子标记辅助选择，成功构建了仅携有QTL qBlsr3d的单染色体片段代换系，命名为H359-BLSR3D。进一步通过分子标记定位分析表明：渗入区段位于第 3号染色体分子标记3DSSR3和3DSSR12之间，物理距离约为1 250 kb。田间接种鉴定表明：H359-BLSR3D与感病亲本H359间的细条病抗性差异显著，结果证明了抗性QTL qBlsr3d的真实存在。H359-BLSR3D将为QTL qBlsr3d的精细定位和最终克隆奠定基础。