贾继增等：小麦D基因组框架图绘制及其应用展望
《中国农业科技导报》2013年第2期, 作者：贾继增 孔秀英 赵光耀 高丽锋
普通小麦(Triticum aestivum)是异源六倍体（AABBDD, 2n=42），它是在大约1万年前在西亚的“新月沃”地区由四倍体小麦（Triticum turgidum, AABB, 2n=28）与粗山羊草（Aegilops tauschii, DD, 2n=14）天然杂交而成（图1）。小麦的适应性强，是世界上分布最广的作物。小麦的抗寒性极强，是北半球冬季唯一能够在大田越冬的主要粮食作物，能够防止土壤风蚀，保护环境。普通小麦是异源多倍体，可作为多倍体的模式物种，在基础研究上具有重要意义。加强小麦的基因组学研究对于小麦育种、种质资源、功能基因组、进化及比较基因组研究都将产生巨大的推动作用。
图1 普通小麦、硬粒小麦和二倍体祖先种的进化关系及其基因组组成
（Shewry PR et al., Journal of Experimental Botany, 2009, 60(6): 1537–1553）
1 小麦基因组学研究现状
1.1 小麦基因组学研究相对滞后
论文是科研成果的重要体现。论文的发表数量在一定程度上能反映了某种作物的研究水平。据对NCBI数据库收录的论文数统计，在20世纪90年代中期之前，国际上小麦论文的发表数量远高于水稻等其他作物（图1）。但在进入基因组时代之后，由于水稻基因组测序取得突破，有关水稻的研究论文数量也遥遥领先，而小麦研究严重滞后（图2）。
图2 基因组时代前后小麦与水稻发表论文数量的对比
1.2 国际上小麦基因组学研究概况
二代测序仪的研发与推广大大加快了小麦基因组测序的进展。目前国际上进行小麦基因组测序主要有两条技术路线。一条是以国际小麦测序协作组织（International Wheat Genome Sequencing Consortium, IWGSC）为代表的分染色体测序策略。目前小麦的21条染色体已被18个国家“认领”（图3），我国的西北农林科技大学也参与其中。另一策略是全基因组鸟枪法测序。该技术路线的要点是建立不同片段大小的测序文库，利用二代测序仪进行深度测序，然后进行组装与分析。中国科学院遗传与发育生物学研究所与深圳华大基因研究院合作完成了小麦A基因组框架图的绘制；本课题组与深圳华大基因研究院等单位合作，完成了小麦D基因组框架图的绘制。
图3 国际小麦测序协作组中国春小麦单条染色体物理图谱构建承担的国家
2 小麦D基因组框架图的绘制
选用粗山羊草Y2282（即AL8/78）为材料进行测序、组装与基因注释获得D基因组的框架图。分析发现D基因组的大小应为4.36Gb，框架图中包含有34 498个高可信度基因，8 652个低可信度基因，基因总数为43150个；基因的平均长度为2873bp，有4.9个内含子，多于水稻（3.8）与玉米（4.1）；小麦的重复序列占基因组的绝大部分。利用GBS（genotyping by sequencing）技术构建了高密度遗传图谱，并最终将占基因总数的71%的30697个基因绘制于染色体上；研究发现D基因组中的抗病、抗逆与品质相关基因与水稻、玉米等物种相比有显著扩增，重复序列在大约300万年前也有显著扩增。推测这些基因与重复序列的扩增与小麦的强适应性与特殊的加工品质关系密切。
3 D基因组框架图的应用途径
小麦D基因组测序为小麦功能基因组、基因资源与基因组设计育种提供了大量的、宝贵的基因组信息与基因信息，这些信息可用于新基因发掘、基因组设计育种、单倍型作图与变异组等多项研究。
3.1 在新基因发掘中的应用
新基因发掘是功能基因组学的主要研究内容，也是分子育种与基因组设计育种的基础。此前由于没有基因组序列，因而小麦的新基因发掘进展异常缓慢。小麦D基因组框架图将从以下几个方面促进小麦基因克隆：（1）提供了数以万计的分子标记。D基因组测序共发现了711,907个SNP标记，860,126个SSR标记，这些标记分布遍及全基因组，能基本满足基因图位克隆与关联分析基因克隆的需求；（2）构建了一个包含15万个SNP标记与25752个scaffold的具有序列信息的高密度遗传图，其中具有24812个基因的位置和序列信息，可为基因克隆提供标记与序列信息；（3）提供了43150个基因信息，包括基因的结构、功能注释与表达信息，将有助于正向遗传学的基因预测及反向遗传学的基因功能研究。
3.2 在小麦基因资源多样性与单倍型作图中的应用
基因组学研究发现多样性应包括基因结构多样性、拷贝数变异（copy number variation, CNV）多样性与甲基化多样性。D基因组测序所开发的基因分子标记及基因信息，可用于揭示基因结构变异多样性；测序发现有大量的基因发生了复制，拷贝数发生了变异，利用这些拷贝数变异的基因作为候选基因，通过TaqMan®等技术，可检测拷贝数变异；为全基因组甲基化测序提供了参照序列，用于分析全基因组甲基化变异。
单倍型区段是指基因组中不易发生重组的一个区段。单倍型作图即确定基因组中的单倍型区段的大小、分布与功能。利用开发的高通量分子标记，可以进行D基因组的单倍型作图。通过比较野生种、地方种与现代育成种的单倍型差异，可以明确驯化与现代品种改良过程的基因组区段及其功能；通过比较主栽品种与普通品种、普通亲本与骨干亲本、不同年代与不同生态区育成品种、亲本与后代的单倍型作图差异，将能够将几百年积累的丰富而宝贵的育种经验上升到基因组理论的水平，从而完成育种这门古老的学科由“艺术”到科学的升华。
3.3 在小麦改良上的应用
小麦品种改良对世界农业生产与粮食安全产生了有目共睹的巨大贡献。但当前的小麦常规育种进展缓慢。D基因组测序将在上述诸方面对小麦育种产生巨大的推动作用。
在理论上，单倍型作图将促进小麦育种由经验到理论的升华；在技术上，具有基因组序列的高密度遗传图是当前世界上唯一的能提供如此丰富信息的小麦遗传图。该遗传图可以作为参照遗传图对以往的作图信息进行整合。利用本研究提供的大规模SNP信息可进一步研发高密度SNP芯片，进而开发全基因组选择育种芯片，这将将大大提高育种的选择效率；在材料上，大量的研究已经证明普通小麦D基因组的多样性极为贫乏，已成为普通小麦改良与杂种优势利用的瓶颈。小麦D基因组的供体种粗山羊草的多样性极为丰富，D基因组的测序为粗山羊草的进一步开发与利用奠定了基础。通过培育人工合成小麦，并利用人工合成小麦作为供体种与现代育成品种杂交和回交，是开发利用粗山羊草多样性的有效途径。在这个过程中，高密度遗传标记是鉴定粗山羊草导入片段的有效工具。利用人工合成小麦导入系聚合杂种优势位点，可能是杂交小麦取得突破的一条重要途径。还需特别提出的是，由于未来小麦新基因发掘的加快，对小麦分子育种也必将产生巨大的推动作用。
3.4 在比较基因组研究上的应用
D基因组测序结果可用于禾本科植物的比较基因组学研究。D基因组测序首次在全基因组水平揭示了小麦与其它禾本科物种的微共线图(图4)，揭示了不同物种在进化过程中的基因组的保守区与易变区段。通过与水稻、玉米、高粱、大麦、短柄草等物种的基因比较，发现了各物种各类基因的数量及其特有的基因。比较发现小麦D基因组特有的与加工品质相关的基因，如高分子量谷蛋白基因（HMW-GS）、低分子量谷蛋白基因（LMW-GS）与硬度基因（Ha等）。正是这些基因使得小麦与其它物种相比具有更强的适应性及多样化的加工品质（制作面包、馒头、面条等）。也正是这些基因，使得小麦成为世界上适应性最强的粮食作物。除进行基因比较外，还可进行重复序列的比较。研究发现小麦的基因组膨胀主要是由于其重复序列在大约300万年前迅速扩增造成的，而这一时期正是北半球气候变冷、干旱及草原化的时期。基因组扩增是否与当时的气候变化有关，是一个值得深入研究的课题。
图4 小麦D基因组与大麦、短柄草的比较作图
图中最内测的是D基因组的1D-7D，中间是大麦的H基因组的1H-7H，最外侧的两个环是短柄草的Bd基因组Bd1-Bd4染色体。每条染色体下面的彩色线表示鉴定出来的粗山羊草、大麦和短柄草物种之间假定的直向同源基因。
3.5 在小麦进化与多倍体研究上的应用
小麦属的二倍体、四倍体与六倍体等不同倍性的种完备，又是重要的粮食作物，是理想的研究多倍体进化的物种。研究发现在多倍化的过程中，基因的数量会发生显著的变化。在多倍体形成过程中二倍体祖先种中的大量基因在形成多倍体的过程中发生了丢失、基因的功能会发生分化或表达量发生了显著变异。D基因组测序为在全基因组水平研究多倍体的进化与基因表达成为可能。通过比较普通小麦、人工合成小麦及其二倍体与四倍体亲本中的基因组结构变异与基因表达变异，将能够在全基因组水平揭示基因组变异情况。
4 结语
小麦D基因组框架图的绘制结束了小麦没有全基因组组装序列的历史，标志着我国小麦基因组研究已进入世界先进行列。毫无疑问，它将对小麦的结构基因组学、功能基因组学、比较基因组学、育种学等学科产生巨大的推动作用，促进小麦科学进入一个新的发展时期。但是，目前我们还仅仅是完成了D基因组的一个框架图，小麦二倍体B基因组、四倍体AB基因组与六倍体ABD基因组的基因组测序还没有完成；高效的功能基因组研究平台还没有建立；单倍型图谱尚未建立；基因组设计育种还仅仅是个设想，尚未付诸实践。当前是我国发展小麦基因组学前所未有的大好时机，加大小麦基因组研究的投入，做好顶层设计，集中精力做好上述几件在小麦科学发展史上具有重大影响的大事，我国将对世界小麦科学的发展做出前所未有的巨大贡献。
（中国农业科学院作物科学研究所，农业部作物基因资源与种质创制重点实验室， 国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程，北京 100081）
