分子植物育种 － 2014年第12卷第2期目录

DNA复制起始识别复合物ORC (origin recognition complex)是一个六亚基复合物，在真核生物DNA复制起始中发挥关键作用。根据酵母、果蝇等物种的研究结果，ORC在基因沉默、转录调控、胞质分裂及核糖体形成等生命过程中也具有重要功能。随着植物分子生物学与基因组学的发展，越来越多的研究者开始关注植物ORC基因的功能。本文综述了植物ORC基因与蛋白结构、表达模式、亚基间互作、基因功能等领域的研究进展，以期为进一步研究该基因在植物中的功能和进化关系提供有价值的参考。

WRKY转录因子具有特殊的锌指结构，是植物重要的转录调节因子家族之一。其主要存在于高等植物中，参与植物体生物与非生物胁迫反应，调节植物发育与诸多代谢相关基因的表达。脱落酸是一种普遍存在于植物中具有倍半萜结构的激素，既可作为平衡植物内源激素及生长活性物质代谢的关键因子，又可作为植物胁迫反应的重要信号分子。有研究表明，脱落酸代谢循环受WKRY转录因子的精细调控。为深入了解上述调控机制，本文综述了WRKY转录因子在植物脱落酸信号转导中起到的关键作用。

油菜是四大油料作物之一，同时也具有很高的观赏价值。甘蓝型油菜作为主要的油菜类型，其花色的改良可以提高观赏性，促进农业和旅游业的融合发展，提高农民收入。本文综述了近几年油菜花色突变体的研究进展、观赏植物花色遗传改良方法及转基因油菜研究现状，探讨了通过基因工程技术导入花色苷合成相关基因进行油菜花色遗传改良的方法。

八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase, PSY)是类胡萝卜素合成途径首要限速酶，催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)合成八氢番茄红素。在很多作物中存在2~3个PSY旁系同源基因，呈现出组织特异性的功能分化。通过转基因技术改良其在水稻、大豆等作物中的表达，可以显著提高类胡萝卜素含量。本文针对不同植物PSY基因结构、资源多样性、功能及调控机制最新研究进行阐述，为改良和选育高类胡萝卜素含量作物品种提供有效依据。

NBS-LRR (nucleotide binding site-leucine rich repeat)是植物中所含抗病基因数目最多的基因家族，也是植物基因组中最大的基因家族之一。本文全面综述了国内外植物NBS-LRR抗病基因家族的研究进展，主要包括植物 NBS-LRR 抗病基因的克隆、结构、功能及其起源进化；进一步阐述了该基因家族在抗病基因同源序列克隆、分子标记开发、基因定位等方面的应用，同时对植物 NBS-LRR 抗病基因家族研究中存在的问题及未来研究方向进行了探讨。本文旨在为进一步开发和利用 NBS-LRR抗病基因提供理论依据，为其他抗病基因的研究提供参考。

WRKY转录因子是一超级基因家族，数目众多，广泛参与植物生长发育及次生代谢等过程，并在植物抵御各种生物及非生物逆境胁迫发挥十分重要的功能。本研究根据WRKY基因家族的一员AtWRKY26的cDNA序列信息进行克隆，通过 PCR扩增、酶切、连接等把AtWRKY26基因片段连接到质粒pBI121上构建转基因过表达载体，为AtWRKY26基因转化及后续的功能鉴定奠定基础。

TA克隆载体由于能够用于PCR产物的快速克隆，且操作简单，因此被广泛应用。本研究的目的在于构建一种可以直接连接PCR产物的TA克隆植物表达载体，其在植物细胞中表达的筛选基因为nptⅡ。首先我们向植物表达载体pRNAi-BKI1 中引入包含2个XcmⅠ酶切位点的TA克隆位点序列，然后对pRNAi-BKI1载体原有的3个XcmⅠ酶切位点逐一进行定点突变，最终获得了以nptⅡ为筛选基因的TA克隆植物表达载体，命名为pTO。用XcmⅠ酶切pTO载体，得到两端含有T末端的线性载体，该线性载体可以直接与PCR产物连接。为了验证pTO载体的有效性，本研究利用PCR技术从pRI 201-AN-GUS载体上扩增GUS基因全长序列，将GUS基因连接到pTO载体上，构建出GUS基因的过表达载体 pTO-GUS。将pTO-GUS导入根癌农杆菌EHA105，并进行烟草叶片转化。利用GUS组织染色法对侵染后的烟草叶片进行GUS瞬时表达分析，结果显示pTO-GUS上的GUS基因在烟草细胞中高效表达。本研究获得的pTO载体适合用于构建目的基因的过表达载体，可以直接连接PCR产物，节省载体构建的步骤和时间。

甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium (Fisch. ex Trautv.) Makino)可作为菊花遗传育种研究模式植物，但目前尚未建立甘菊的遗传转化体系。本研究在甘菊下胚轴再生体系的基础上，以甘菊下胚轴为外植体，对影响转化体系的5个因素进行筛选，尝试利用农杆菌介导的方法获得最佳转化体系。研究结果表明：甘菊下胚轴在不经过预培养，农杆菌浓度 OD600=0.4 时浸染 10 min，共培养 2 d，延迟培养 1 d时抗性芽分化率和转化率均最高。通过卡那霉素抗性筛选及 PCR检测，获得 45株PCR阳性植株，阳性转基因植株频率为5%。

本研究以苔草属植物10个野生种为试材，采用L16(45)正交试验设计，对影响ISSR-PCR反应的Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物及模板DNA以及退火温度、循环次数等因素进行优化试验。研究结果表明，苔草属植物的最优ISSR-PCR反应体系，即25 μL反应体积中，含Taq DNA聚合酶1.5 U，Mg2+ 1.5 mmol/L，DNA模板150 ng，引物0.24 μmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L。苔草属植物的最佳扩增程序，即：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，退火45 s，72℃延伸1.5 min，38个循环；72℃延伸7 min；4℃保存。采用优化后的体系对10份苔草属植物进行扩增，能扩增出清晰明亮的条带，表明该反应体系和扩增程序适于苔草属植物的ISSR分析，为进一步开展苔草属植物的遗传多样性分析、分子系统学研究及种质资源评价奠定了基础。

黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)是番茄病毒病的主要病原之一，为了研究CMV与番茄相互作用的分子机制，本研究以受CMV侵染的番茄叶片为材料，构建了番茄的cDNA文库。文库总库容量为2.346×106 cfu，其中0.5~1 kb片段文库库容量为1.02×106 cfu；1~2 kb片段文库库容量为8.56×105cfu；大于2 kb片段文库库容量为4.7×105 cfu。三个子文库各检测20个克隆，重组率为100%。随机挑取 30个克隆进行测序，获得 29条有效序列，有 23条序列包含完整的开放阅读框，表明获得的文库质量较高。高质量番茄cDNA文库的获得，为研究 CMV- 番茄相互作用奠定了基础。

为探究苹果属富含多糖多酚物质的平邑甜茶总RNA提取的最优方法，本研究以平邑甜茶的幼嫩叶片、盛花期子房、花瓣和萼片为材料，利用常规CTAB法和试剂盒法(TIANGEN生化科技有限公司提供的RNAprep Pure多糖多酚植物总 RNA提取试剂盒)分别提取平邑甜茶不同器官、组织的总RNA，并对RNA浓度和和电泳图谱进行比较分析。研究结果表明：利用天根生化科技公司提供的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒可提取到纯度较高，完整性较好的总RNA，可以用于获取 cDNA全长、RT-PCR及荧光定量RT-PCR等分子生物学实验。

为验证电子克隆技术获取茶树功能候选基因的可行性，本研究以可可的咖啡碱合成酶基因BCS1为探针，对构建的茶树 EST数据库进行本地BLAST检索，获得与BCS1具有高度同源性的茶树EST序列26条。将26条茶树EST序列经程序 CAP (contig assembly program)拼接，得到2条含有独立ORF的EST簇(Contig)，分别命名为基因TCSnew1 和TCSnew2。 将这2个基因与GenBank中由实验方法克隆得到的茶树咖啡机合成酶基因TCS的cDNA进行核酸序列、推导氨基酸序列比对，及构建系统发育树进行3个基因推导氨基酸序列间的同源性分析。结果发现，茶树远缘物种的兴趣序列作为探针用于电子克隆获取茶树功能候选基因与实验克隆技术相同，是一条可行的技术途径。

甘蔗野生种蔗茅抗旱、耐寒，在甘蔗抗逆育种中具有较好的应用前景，为更有效的将蔗茅应用于现代甘蔗新品种的选育及旧有甘蔗品种的改良，有必要对蔗茅资源的遗传多样性进行研究。本研究利用12对引物对48份采自不同省区的蔗茅无性系进行SSR分析，共扩增出266条带，其中多态性带总数为237条，多态率达89.10%，说明此蔗茅无性系间存在较丰富的遗传多样性；从聚类结果可以看出这48份蔗茅无性系可分为4个群体；结果还表明蔗茅的采集地与聚类结果并没有直接的对应关系。研究结果可为这些蔗茅无性系在甘蔗育种中的进一步利用提供科学依据。

以不同倍性的亚洲百合品种为亲本进行了21组杂交，观察杂交亲本和杂交子代的染色体数目，旨在研究百合杂交亲和性与染色体倍性之间的相关性。结果发现：Renoir和Gironde为二倍体，Navona为三倍体，Detroit、Loreto和Tresor为四倍体；二倍体和四倍体百合不同倍性间杂交存在一定程度的不亲和性，杂交子代为三倍体；百合三倍体通常雄性不育，但在杂交时可以作为母本，杂交子代为非整倍体，且3x伊4x杂交亲和性高于3x伊2x杂交。研究结果表明，不同倍性百合品种作为亲本的杂交亲和性不同，子代的倍性也不同，这对百合育种选配亲本具有参考和指导意义。

本研究调查了一年生辣椒和中华辣椒种的DNA甲基化多样性。选取了24个一年生辣椒栽培种和6个中华辣椒栽培种作为研究对象，采用MSAP (methylation-sensitive amplification polymorphism)技术对其基因组CCGG位点的甲基化多样性进行了分析。结果表明，从63对MSAP引物中筛选出5对重复性好、条带清晰的引物对，对30份辣椒种质基因组 DNA进行MSAP扩增，得到939条带谱，其中多态性条带937个，多态性比例高达99.79%。DNA甲基化模式分析表明，类型玉为非甲基化带型(3721)，类型域为半甲基化带型(3152)，类型芋为全甲基化带型(3839)，辣椒甲基化模式主要以全甲基化为主，一年生辣椒(Capsicum annuum L.)和中华辣椒(Capsicum chinense Jacquin)甲基化条带平均分别为319和 217，其扩增位点的甲基化率分别77.24%和63.64%，差异达极显著水平。基于相似性系数的UPGMA法聚类分析，在 0.68相似水平可以将30个种质分为3个类，第1类：No.10~No.13和No.15共5个种质，其中No.10 为一年生辣椒，其它 4个为中华辣椒；第2类：No.2~No.9、No.14、No.16~No.30，其中No.14和No.17为中华辣椒；第3类：只有No.1，为一年生辣椒。应用MSAP未能将一年生辣椒和中华辣椒区分开来，表明辣椒表观遗传十分丰富。Nei's基因多态性指数(h)和Shannon信息指数(I)在2个栽培种中分别为0.204 0和0.329 8、0.186 4和 0.297 5，一年生辣椒的表观遗传多样性稍高于中华辣椒。DNA甲基化多样性作为标志遗传多样性的一种信号源，本研究结果为深入探讨辣椒种群分化及物种进化奠定了基础。

热激转录因子(heat shock transcription factors, Hsfs)是调节植物响应高温胁迫的主要因子，参与调节热激蛋白(heat shock protein, Hsp)的表达，对植物抵抗高温逆境等生命活动具有关键作用。本研究以大白菜和甘蓝基因组数据为基础，利用生物信息学方法对大白菜和甘蓝整个基因组的Hsf基因家族进行鉴定与分析。结果表明，大白菜至少含有30个Hsf基因成员，蛋白长度在239~487氨基酸之间；甘蓝至少含有36个Hsf基因成员，蛋白长度在219~495氨基酸之间。序列比对发现，大白菜和甘蓝Hsf基因都具有高度保守的DBD (DNA binding domain)结构域和广泛的保守基序；染色体定位发现，大白菜和甘蓝Hsf基因家族成员广泛的分布在各染色体上。此外，对拟南芥、大白菜和甘蓝Hsfs的系统发育分析表明，这些Hsf基因家族成员可以分为A、B、C三类，A类和B类可进一步分为8个和4个亚类，A类Hsfs的保守性明显高于B类和C类。系统发育树还揭示了在这三个物种中，共存在28对直系同源基因和2对旁系同源基因，表明Hsf转录因子在大白菜、甘蓝和拟南芥基因组中具有广泛的共同祖先，Hsf基因家族的多样化存在于十字花科植物分化之前，并且在甘蓝基因组中发生了基因重复。

TCP基因家族是植物中一类特有的转录因子家族，广泛参与植物的生长发育以及各种生理生化反应的信号传导。为了揭示黄瓜TCP基因家族的功能，本研究利用全基因组信息鉴定黄瓜TCP转录因子家族，分析结构特征及系统发育关系。结果表明，黄瓜全基因组共编码22个TCP转录因子成员，分布在5条染色体上；内含子/外显子结构分析表明，大多数 TCP基因结构较为简单，不含有内含子；序列分析发现这些家族成员都含有高度保守的非典型bHLH结构域；根据结构域差异和系统发育关系分析的结果，将黄瓜TCP转录因子家族分成2个亚家族；启动子元件分析显示，TCP基因含有大量参与调控分生组织发育的元件。这些结果将为今后揭示黄瓜TCP基因家族成员的功能奠定理论基础。

本研究利用SSR分子标记研究薯蓣属(Dioscorea L.)四种植物：盾叶薯蓣(D. zingibiernsis C.H Wright.)、小花盾叶薯蓣(D. sinoparviflora C.T. Ting)、黄独(D. bulbifera L.)和山药薯蓣(D. opposita Thunb)的遗传变异及亲缘关系，从21对引物中筛选出多态性在54.55%以上的引物11对。再利用这11对引物对17份分别为这四种薯蓣植物材料的基因组DNA进行扩增，共扩增出138条带，其中多态性条带数为136条，平均多态性比率为98.55%，参试材料的相似系数为0.41~0.90，平均相似系数为0.63。各样品间的遗传相似系数经UPGMA聚类分析，结果发现盾叶薯蓣与山药之间、小花盾叶薯蓣与盾叶薯蓣、盾叶薯蓣与黄独的平均相似系数分别为0.56、0.53和0.47。结果表明，四种植物的亲缘关系：盾叶薯蓣与山药较近，其次是小花盾叶薯蓣，最远是黄独。

构建甘薯分子连锁图谱，并对重要农艺性状进行QTL定位，进而克隆相关性状的主效基因，是甘薯育种研究的重要方向。在甘薯的农艺性状中，高胡萝卜素含量是重要育种目标之一。本研究利用低胡萝卜素含量甘薯品种漯徐薯8号(母本)和高胡萝卜素含量甘薯品种郑薯20 (父本)杂交，以F1分离群体240个株系为材料，构建分子连锁图谱。父本57个连锁群，图谱的总长度4 968.62 cM，标记间平均距离10.35 cM；母本64个连锁群，图谱总长度为5 313.67 cM，标记间平均距离10.76 cM。以测定的β-胡萝卜素含量为指标，用MapQTL4.0软件检测到17个与甘薯β-胡萝卜素含量相关的QTLs，其中10个定位在父本图谱上，7个定位在母本图谱上，分别解释甘薯β-胡萝卜素含量表型变异的 33.1%~62.1%。研究结果有助于甘薯胡萝卜素合成相关性状基因的克隆及分子标记辅助育种体系的建立。

可溶性酸性转化酶(SAI)是甜高粱蔗糖代谢关键调控酶。本研究利用RT-PCR的方法，克隆得到了甜高粱SAI-1基因 cDNA全长序列(Genbank No.: KF921516)，并利用生物信息学方法对其结构以及蛋白功能进行了分析。结果表明：克隆得到的SAI-1 cDNA序列长 2 345 bp，包含一个 2 025 bp的编码区、 210 bp的5'非翻译区和110 bp的3'非翻译区。其编码674个氨基酸蛋白，预测分子量为73.42 kD，等电点为5.76，蛋白序列含有一个完整的糖基水解酶家族32结构域，具有水解蔗糖的作用。甜高粱茎秆中的SAI-1表达水平在拔节和抽穗期较高，而在开花期后的各个时期均处于较低水平，这与甜高粱糖分积累呈负相关。本研究结果为进一步研究SAI-1基因调控甜高粱糖分含量的分子机制奠定了基础。

以美国半矮杆大豆品种Charleston为母本（♀），中国品系东农594为父本（♂）杂交，衍生的F2:12~F2:14含147个重组自交系，2007~2009年分别在3个环境下种植，测定收获大豆种子油分含量。采用Shukla法计算油分含量的遗传稳定性，将稳定性结果利用复合区间模型和混合线性模型的复合区间作图法进行QTL分析。4个大豆油分稳定性QTL (sqOIL7-1, sqOIL8-1, sqOIL15-1和sqOIL12-1)通过复合区间作图法检测到，他们分别位于连锁群D1a、D1b、J和 G上，贡献率分别为5.33%、14.61%、5.83%和5.37%。混合区间作图法检测到4对上位性QTL，贡献率分别为 5.65%、 11.42%、15.19%和18.32%。研究结果对大豆油分含量重要基因的挖掘及油分相关性状的分子辅助育种提供了重要理论依据。

解析已育成的高产稳产油菜品种大地55的遗传基础，可以为后续油菜品种的培育提供借鉴和理论指导。本研究采用油菜 60K SNP芯片对包括大地55亲本在内的5个保持系和7个恢复系间的遗传距离进行估算，发现大地55亲本间的遗传距离较大，为0.54，在所有35个组合中居第2位，是大地55杂交种能够产生强优势的遗传基础。用192对SSR引物对大地55的亲本1055A和R6进行扩增，并用杂种F1的DNA进行验证，筛选出4对可以对大地55进行纯度鉴定的引物(Ra2-G08, Ol11-H02, P052和P069)。采用Ra2-G08、Ol11-H02对大地55杂交种进行室内检测，纯度为94.3%，这批种子田间种植鉴定结果为95.1%，室内检测结果与大田种植鉴定的结果非常接近，说明用SSR标记可以对其种子纯度进行准确鉴定，从而为大地55在生产上安全应用提供保障。

本研究以分子标记辅助选择(MAS)手段和回交转育方法相结合培育出的单抗丝黑穗病和单抗茎腐病京24抗病改良系为基础材料，经杂交、自交一代，结合MAS和抗性接种鉴定方法，以实现抗丝黑穗病和抗茎腐病主效QTL在京24基因组上的聚合。利用毛细管荧光电泳检测手段，在供受体间筛选到2对丝黑穗病前景选择引物(STS148, MZAI)和2对茎腐病前景选择引物(449B, 483)，可用于抗病基因聚合中主效抗性QTL的分子标记辅助选择。对单抗丝黑穗病改良材料和单抗茎腐病改良材料杂交得到的 F1代群体各单株进行田间抗性接种鉴定，F1代群体丝黑穗病和茎腐病发病株率分别比受体京24 降低44.8%和37.2%。利用MAS，从205个F2代分离植株中检测到9个纯合双抗株。结果验证了利用 MAS辅助选择抗病主效基因聚合的可行性，获得的双抗改良系作为抗病育种的新材料为抗病品种选育和抗病基因进一步聚合提供了材料基础。

本研究通过形态学、细胞学、分子标记和GISH检测对小麦-黑麦代换系5R/5A伊6R/6A杂种后代的6个品系进行鉴定，为选育带有R组染色体片段的易位系，给小麦育种提供基础材料。结果表明，6个品系染色体数目均为2n=42，花粉母细胞减数分裂中期玉染色体构型正常；黑麦特异引物pSC119.1检测，确定6个品系均含有黑麦染色质成分，5对SSR 特异引物SCM138、SCM120、SCM268、CGG18和SCM180在10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6 6个品系中分别扩增出5R或6R不同大小的特异片段；GISH结果显示，染色体端部均出现黑麦的黄色或黄绿色信号。以上结果证实6份材料均为小麦-黑麦易位系，形态检测表现有黑麦的某些优良性状，如大穗、多小穗、抗旱、抗叶锈病，白粉病等，可作为小麦育种的基础材料，对小麦遗传改良和抗性研究具有重要的利用价值。

为构建河南旱稻种植品种的DNA指纹图谱，了解河南旱稻的遗传多样性，本研究利用均匀分布于水稻12条染色体的38对SSR引物，以河南主要推广种植的10个旱稻品种为材料，进行遗传多样性分析并构建SSR指纹图谱。结果表明， 35对引物具有多态性片段，共检测到108个等位基因，平均每位点3.1个等位基因；引物平均多态性频率为0.485。10 个品种间的遗传相似系数为0.435~0.907，平均0.678。利用RM552、RM171、RM5、RM308、RM338、RM17和 RM587 7对多态性较高的SSR引物构建的核心指纹图谱能区分出10个旱稻品种。采用非加权类平均法进行聚类分析，在遗传相似系数0.480处可将10个品种分为籼、粳两大类。

子预44是具有广谱持久抗瘟性的云南地方粳稻品种。为揭示子预44广谱持久抗瘟分子机制，本研究利用Shang等(2009)设计的三对假基因化PCR标记，对Pib、Pi9和Pid3三个广谱抗瘟基因在子预44、江南香糯、日本晴和籼稻93-11中等位基因假基因化情况进行了检测和分析。研究结果表明，在大多数粳稻品种中发生假基因化的Pib、Pi9和 Pid3 三个等位基因在粳稻子预44中均未发生假基因化。我们推测粳稻子预44的广谱持久抗瘟特性可能与其稻瘟病抗性基因假基因化频率较低，含有多个稻瘟病抗性基因有关。

本研究利用转基因技术将直立型密穗基因dep1导入籼稻成熟胚愈伤组织中，以期获得直立穗型转基因水稻植株。结果显示已获得209个转基因再生植株，PCR检测结果表明阳性植株189株，阳性率90.4%；Southern Blot和RT-PCR检测结果表明目的基因已经整合到9R406基因组中，并且在转基因植株后代中能够稳定地遗传和表达。T1代转基因再生植株农艺性状考察结果表明，与对照相比，部分株系株高降低，穗粒数和实粒数增加，穗长变短，千粒重减小。

以珍汕97和德陇208两个籼稻品种为亲本杂交构建的重组自交系(Recombinant inbred line，RIL)群体为材料，通过包含有179个简单重复序列(SSR)标记的遗传连锁图谱，全基因组对2011年糙米中维生素E的8个异构体(α、β、γ、δ-生育酚和α、β、γ、δ-生育三烯酚)含量进行数量性状位点(QTL)定位分析，共检测到4个QTLs，其中α-生育酚在第1染色体上检测到一个QTL，γ-生育酚在水稻第2染色体检测到一个QTL，δ-生育三烯酚在2和6染色体上分别检测到一个QTL。所有QTL中仅控制γ-生育酚含量的QTL是亲本德陇208上的等位基因起增效作用，余下的3个QTL均来自于珍汕97。维生素E是水稻重要的营养品质之一，研究水稻中维生素E的遗传基础，为进一步阐述水稻中维生素E合成的分子机制及水稻营养品质改良提供基础。