SMRT测序：评估基因编辑效果的新利器

来源：生物探索

新兴的CRISPR技术在短短一年多的时间内，掀起了基因组编辑的热潮。然而，对这些基因改造手段的效率和结果，我们仍难以评估。目前的一些工具，如荧光报告基因、克隆分析，缺乏生成报告细胞系时所需的灵敏度。高通量测序方法虽能科服这一问题，但无奈读长太短，而供体DNA模板往往很长。

目前，还没有一种测序平台能同时评估非同源性末端接合（NHEJ）和同源介导修复（HDR）的发生频率，而这正是双链DNA断裂的两种主要修复机制。近日，单分子测序带来了一个好消息，研究人员证实，单分子实时（SMRT）测序技术能够同时测定任何位点的基因组编辑结果。这项研究成果发表在3月27日的Cell Reports上。

研究由来自斯坦福大学的Matthew Porteus领导。研究人员在文中指出，这种方法可应用于各种基因组编辑平台，包括TALEN、CRISPR/Cas9和锌指核酸酶（ZFN），以确定理想的改造结果出现时的条件和策略。

靶向基因组编辑，让研究人员能够在基因组中几乎任何位点，引入精确的序列修饰。然而，研究人员指出，这些基因组修饰策略并不总是带来理想结果。“精确的基因组修饰……取决于断裂是由NHEJ修复的，还是有HDR修复的。如果断裂由NHEJ修复，在断裂位点可能会引入小的插入或缺失。不过，若由HDR修复，就能引入理想的序列变化，形成特定修饰。”

作者认为，SMRT DNA测序带来了一下优点：

1. 灵敏测定任何细胞类型中的基因组编辑，包括原代干细胞，而不需要构建稳定的报告细胞系；

2. 测定内源位点的修饰，而不管其转录状态如何；

3. 在使用携带长的同源臂的供体模板时，长的测序读长带来了清晰的DNA修复结果。

此外，作者还提到：“我们的策略为研究DNA修复的通路提供了一种方法，而之前的方法难以研究。SMRT DNA测序能够灵活评估任一位点的基因组编辑结果，而不需要开发报告系统，从而简化了基因组编辑项目的开发，也扩展了这些技术的应用。”