Bt抗虫基因及其克隆技术研究进展

文/张杰 束长龙

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种具有特异杀虫活性的细菌，能产生多种对昆虫有特异活性的杀虫蛋白，包括cry和cyt基因编码的杀虫晶体蛋白( insecticidal crystal proteins, 简称ICPs)，以及营养期分泌的杀虫蛋白Vip ( vegetative insecticidal protein , 简称Vips)。

从1938 年起，Bt被大规模开发成微生物杀虫剂用于害虫防治，取得了良好的经济效益与生态效益。自1996年起，导入Bt特异抗虫基因的转基因作物被批准商业化种植，2013年全球棉花、玉米等多种抗虫转基因作物总种植面积达到了7000万公顷（折合10.5亿亩）。Bt抗虫基因巨大的应用价值和市场开发前景引起国内外相关研究机构和企业的高度关注，不断加大投入，进行杀虫基因新资源的发掘和保护，这一领域的竞争也越加激烈。

长期以来，多种分子生物学方法被用于Bt杀虫基因的鉴定与克隆。最先发展起来的是基于蛋白质分析的克隆方法。该方法通过纯化获得具有杀虫活性的蛋白质，进一步利用蛋白测序技术获得部分氨基酸序列，再通过基因组文库或PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应，一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术）等基因组步移技术获得全部编码杀虫蛋白的DNA序列。该技术以杀虫蛋白为研究分析对象，以功能活性为检测依据，是对Cry蛋白进行鉴定最直接、最有效的方法，可以获得全新的杀虫基因，第一个Bt杀虫基因就是利用该技术克隆获得的。但是由于该技术存在纯化费用昂贵、步骤繁琐、操作复杂等问题，目前已较少使用。

与蛋白质分析的克隆方法相比，基于PCR技术的杀虫基因鉴定克隆方法具有廉价、便捷、快速等优点，已经被广泛用于杀虫基因鉴定与克隆。中国农业科学院植物保护研究所优化了基于PCR-RPLP（聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性）技术的杀虫基因鉴定克隆体系，首先通过生物信息软件在一定的基因群体范围内定位基因保守区域，并设计适用于某特定类群杀虫基因的通用引物，进行PCR扩增，获得菌株样品含有基因片段，进一步通过限制性酶切分析酶切图谱差异、熔解曲线分析DNA Tm值差异或利用测序仪直接测定序列差异的方法对杀虫基因进行鉴定。优化后的基因鉴定方法提高了杀虫基因鉴定的精度，拓宽了检测范围。近三年来基于高通量基因组测序的Bt杀虫基因克隆技术快速发展。该方法通过高通量测序、拼接获得菌株基因组序列，进一步通过基因预测与比对，筛选获得杀虫基因序列，不仅可直接获得杀虫基因序列，而且各步骤过程易于实现自动化，应用前景更加广阔。

近年来中国农业科学院植物保护研究所利用上述技术鉴定克隆，并获国际Bt杀虫基因命名委员会的正式命名的Bt杀虫基因达到126个（cry基因106个，vip基因21个）。其中包括创新性突出、应用价值高、具有自主知识产权的模式基因，如对鳞翅目害虫高效的cry1Ah1、cry1Ie1、cry2Ah1、cry9Ee1，对鞘翅目害虫高效的cry8Ea1、cry8Ga1、cry8Ha1、cry8Ia1等；相关杀虫基因申请国家发明专利33项，获得专利授权23项。目前该所已与中国科学院遗传发育所、中国农业大学、中国农科院生物技术所、、作物所、蔬菜所、大北农集团、奥瑞金公司、中种集团等十余家高等院校、研究院所和知名企业合作，开展抗虫玉米、水稻、棉花、大豆、甘蓝等作物的研究开发。

Bt杀虫基因国际命名委员会网站迄今公布的cry基因总数已达775个，vip基因117个。值得一提的是近五年（2009-2014）各国Bt新基因发掘速度不断加快，全球新发现了322个cry基因、60个vip基因，其中165个cry基因、37个vip基因来自中国，占新基因总数的一半以上,显示了中国功能基因研究自主创新的飞速进步和强大实力。

目前，由中国农业科学院植保所主导，与国际Bt杀虫基因命名委员会、英国Sussex大学、美国Ohio州立大学等国外专家合作，正在着手全球Bt杀虫基因、蛋白活性、菌株等数据信息资源的整合工作，相关数据库有望在今年10月份在中国建立和正式公开。中国的Bt研究将进一步走向世界，为推动全球杀虫微生物和生物技术研究做出更大贡献。