“单分子”与“单细胞”技术时代的生命科学研究

1月5日，来自西班牙光子科学研究所(ICFO)的研究人员在《自然·方法》(Nature Methods)杂志上报告称，他们首次在单分子水平上，确定了多个荧光蛋白的光激活效率，这一评估体系对于单分子计数非常重要。

1 单分子检测技术的发展

传统的生物学研究中，大多数的分子实验是探测分子的综合平均效应，然而生物大分子的研究往往需要对分子的某些特殊的过程进行检测(如酶和底物的结合等)，这就需要实时地了解生物大分子在生化反应过程中的构象变化，而基于荧光光谱的检测方法则自然是生物学研究领域的首选方法。

1959年，费曼提出要对单分子(或单个原子)进行检测，但直到1976年科学家才第一次实现液体中单分子荧光的检测。而后科学家于1989年成功地在低温下首次观察到分子晶体中掺杂的单个分子的荧光，使得单分子检测得以作为超灵敏的检测技术来应用。通过荧光光谱的改进，探测器的优化，以及分析技术的进步，目前单分子荧光检测已经可以在常温下实现。然而，之前对于生物大分子的单分子计数却未有超灵敏的手段。ICFO的研究人员以光控的荧光探针为核心，对局部进行超高分辨率显微分析，激活、成像和跟踪基因编码的荧光蛋白，展现细胞内的蛋白活动，从而在理论上可以对目标蛋白进行分子定量。

2 单分子荧光原位杂交技术已经实现了高通量分析

上文提及的单分子计数可以用于展现正常细胞和患病细胞之间的差异，而之前开发的单分子荧光原位杂交技术，作为基因表达分析方法，能报告转录本丰度和空间定位。在2013年，苏黎世大学分子生命科学研究所的研究人员已经对传统单分子荧光原位杂交技术进行了改进，使之适用于高通量的分析——可以达到多重PCR或RNA-Seq技术所达到的通量。

借助于这些单分子荧光检测的定量计数，还可以研究生物大分子构象的动态变化，如分子马达、聚合酶的运动等。例如，从单分子水平观测到荧光标记的腺体联合病毒侵入细胞的过程，可以用于准确地记录病毒从侵入细胞到进入细胞核的时间等。

3 降噪技术的发展逐步推动单分子检测技术的规模化应用

在单分子检测技术中，消除杂质荧光的背景干扰，是其能否得以在生命科学研究领域大规模应用的关键之一。从探测器的角度来看，采用高效滤光片，利用共焦、近场和消失波激发，是常见的方法。

在前文提及的荧光蛋白光激活率方面，研究人员发现绝大多数荧光蛋白有50%的失败率;将光激活效率纳入考虑，是更适合超高分辨率分子计数的探针的开发策略。在苏黎世大学开发优化的单分子荧光原位杂交技术前，单细胞水平转录的噪音问题也备受关注，但通过18个空间变量的收集则可以更精确地进行分析。

这些技术的开发，或将逐步推动单分子检测技术的规模化应用，从而使细胞和生物大分子的研究更为精确。

4 其他单分子技术的发展

在测序领域，DNA测序已经精确到单个核苷酸。单分子实时DNA测序已作为第三代测序技术获得发展，使得从单个未扩增的分子中产生更长且高度准确的DNA序列。尽管单分子测序技术仍有许多待完善之处，但该技术的发展确实有可能改变分子生物学研究的重点——正如1993年诺贝尔医学奖获得者Richard J. Roberts所言，“随着新一代测序技术的兴起，人们的重点似乎也不放在新发现的基因有何功能，而放在如何让生物体工作上去”。

在免疫学领域，2013年Quanterix公司宣布其单分子免疫阵列技术(SiMoA)(类似于传统的酶联免疫吸附法即ELISA，但较ELISA的灵敏度提高了1 000倍)已可达成多重性检测，可同时检测4种低丰度的细胞因子。多重检测的SiMoA实现后，表明其可与多重PCR一样，在疾病早期检测、血筛、新药研发等领域发挥重要作用。

在药学检测领域，曼彻斯特大学与法国同行合作开发的等离子超介质探测设备，则可以利用可逆的石墨烯氢化反应，使药检达到单分子水平。

从某种程度上看，单分子(及单细胞)技术，或许将会引领未来体内技术的发展。

5 单细胞技术的发展

在单分子技术发展的同时，基于单细胞的研究技术也在不断发展。2013年，Inscopix开发的微型荧光显微镜nVista HD可用于真正实现单神经元细胞水平观测、同时实时检测多达数千神经元的活动，从而实现对整个神经网络的观测。

加州大学圣地亚哥分校利用单细胞基因组测序技术(在12纳升体积、充满液体的小孔中完成了基因组扩充)，完成了对单个大肠杆菌细胞以及人类大脑单个神经元的最完整基因组测序。北京大学则通过对机体的全基因组测序，推断出在受精卵中母源基因组的情况。

而针对分离自几个表面海洋位点的56个单浮游细菌细胞基因组的研究等则表明，单细胞基因组学能够有效地研究新的系统发生关系、域间基因导入和基因组对环境状况的适应等内容。

本文作者：中国科学院上海生命科学信息中心(生命科学研究快报网)于建荣 江洪波