烟草atp2基因CRISPR/Cas9载体构建与遗传转化

植物细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)广泛应用于作物杂交育种及核质互作的分子机理研究。在缺乏线粒体遗传转化技术手段前提下，为了研究线粒体 ATP 合成酶基因敲除对烟草花粉育性的影响，本试验以烟草核基因 atp2 为研究对象，构建烟草 atp2 基因 CRISPR/Cas9 载体并进行遗传转化。结果表明，人工合成的烟草 atp2 基因 20 bp 靶序列连接入 CRISPR/Cas9 载体，通过农杆菌介导叶盘转化，获得8 个 PCR 鉴定为转基因阳性的烟草株系；初步观察发现烟草 atp2 基因编辑 T0 代植株花期延迟，花冠合并，花瓣、雄蕊、雌蕊数目加倍；花粉染色结果显示 atp2 基因编辑植株 crisp-3、crisp-4、crisp-21、crisp-22 的花粉育性分别为 23.60%、30.03%、29.73%和 24.77%，显著低于未编辑植株花粉育性 92.83% (p＜0.01)；crisp-22 的T1 代转化植株表现出叶片皱缩和失绿的突变表型特征。本试验为开展烟草 atp2 基因敲除功能分析，以及利用基因工程创造烟草雄性不育系，奠定了后期的研究工作基础。