三叶青块根发育时期 RT-qPCR 内参基因的筛选与体系建立

三叶青为珍稀药用植物，药用部位地下块根产量低，生长周期长，相关基因表达和调控研究缺乏，为了解其块根发育的分子机制，需筛选稳定表达的内参基因。本研究利用课题组前期的转录组测序数据，选取了 β-actin、GAPDH、RNA polymerase II 和 GBSS 四个候选内参基因，以不同块根发育阶段的三叶青根、茎、叶、芽组织为材料，通过反转录 PCR 初筛，实时荧光定量 PCR 检测表达量，并利用 geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Ct程序和 RefFinder 在线网站评价内参基因的稳定性。结果表明：GAPDH 在不同块根发育及不同组织中的稳定性优于其他基因；β-actin 的扩增效果相对较差；经综合分析稳定性顺序为 GAPDH>GBSS>RNA polymerase II>β-actin，因此本研究认为在研究三叶青块根发育中选用 GAPDH 作为内参，在后续的基因定量表达验证中结果更为可靠。此外，也可以考虑 GAPDH 和 GBSS 或 GAPDH，GBSS 和 RNA polymerase II 的多内参共同校准的方法以进一步提高结果的准确性。本研究建立了三叶青实时荧光定量 PCR 内参基因的筛选体系，为后期开展三叶青块根发育过程中基因的功能调控和表达研究提供了理论依据。