我校与哥本哈根大学合作解析III-B型CRISPR-Cas系统Cmr-β复合体结构和机制
南湖新闻网讯（通讯员 冯明霞）近日，Molecular Cell在线发表了我校与和哥本哈根大学的合作研究成果，题为“Structure of the Cmr-β Complex Reveal the Regulation of the Immunity Mechanism of Type III-B CRISPR-Cas”。该研究结合结构解析与生化实验数据，阐明了III-B 型Cmr-β复合物避免自身免疫与同源靶标RNA激活免疫的机制。
CRISPR-Cas系统是原核生物中由小RNA介导的获得性免疫系统，用于抵御外源移动遗传元件。根据复合物中的标志Cas蛋白，CRISPR-Cas系统被划分为I~VI型，其中I、III和VI型的RNP复合物含多种不同功能的Cas蛋白，归类为Class 1；而II、IV和V型只有单体多功能的Cas蛋白，归类为Class 2。
III型系统具有多种免疫活性，分别为靶标RNA间隔6碱基切割活性，同源靶标RNA激活的单链DNA切割活性与环状寡聚腺苷酸（cyclic oligoadenylates, cOA）合成活性。III-A（Csm）与III-B（Cmr）系统作为III型系统目前发现的两个大亚类型，现只有报道研究III-A型复合物被同源靶标RNA激活的分子机理，但对于III-B型复合物的系统性机理研究目前还比较少。
作者从冰岛硫化叶菌中纯化内源完整的Cmr-β复合物。该复合物解析得到2.75Å的Cryo-EM结构，该结构显示，Cmr-β复合物是一个特殊CRISPR-Cas免疫系统，它含有7种不同蛋白亚基，由37个亚基和一条crRNA组成，其组成成分比例为Cmr11-21-31-44-53-61-726-crRNA1。作者发现，与其他III型复合物不同，Cmr-β复合物的中心结构中的每个亚基均被由两个Cmr7形成的二聚体覆盖（如图 1E 和 F）。该III-B型复合物是目前发现的亚基数最多的、分子量最大的CRISPR效应子复合物。
图1
迄今发现的III型系统具有的同源靶标RNA激活的活性是单链DNA切割活性和cOA合成活性。该研究的作者首次发现，除了以上两种激活活性，Cmr-β复合物还同时具有一个新的核酸干涉活性，即非特异性单链RNA切割活性。
先前的研究表明，III-A型的Csm复合物通过Cas10家族蛋白—Csm1中的一个Linker和loop L1结构参与区分同源和非同源靶标RNA7。然而这些结构在III-B型的Cas10蛋白-Cmr2中并不保守。为了理解III-B复合物如何区分同源靶标RNA和非同源靶标RNA，避免自身免疫机制，作者纯化了靶标RNA切割活性失活的突变体（4βD31A-β），并解析了该突变体+非同源靶标RNA或同源靶标RNA的Cryo-EM结构（3.1Å和3.5Å）。通过结构比较，作者发现，存在于Cmr3中的一个颈环（stalk loop）在这三个结构中呈现不同的构象：在复合物结构里呈现“延伸”，复合物结合非同源靶标RNA后发生旋转，呈“回缩”，结合同源靶标RNA后，消失“不可见”。通过序列比对，作者发现，这个颈环结构保守的存在于III-B系统中。作者指出，III-B复合物与非同源RNA结合后，其crRNA 5’ tag和非同源RNA 3’ antitag互补配对后，Cmr3中的颈环锁定在“回缩”状态，传达一种“自我”的信号，从而避免自身免疫。
为了进一步揭示同源靶标RNA激活Cmr-β复合物免疫的分子机制（即cOA合成，单链核酸切割），作者解析了4βD31A-β复合物+同源靶标RNA+AMP-PnP(ATP类似物)，并得到了两种状态的Cryo-EM结构，简称AMPPnP1（2.41Å）和AMPPnP2（2.68Å）。在此复合物的基础上再加上一条单链的polyT DNA，作者同样得到了两种Cryo-EM结构（polyT1，3.07Å和polyT2，3.14Å）。在这些结构中，Cmr3颈环结构呈现不同的构像变化，“延伸”、“回缩”和“不可见”。
图2
综上所述，不同状态下的多种结构中的颈环结构的构象变化表明，Cmr-β复合物在结合同源靶标RNA后，颈环结构在“延伸”和“回缩”的构型间交替，这种动态平衡似乎控制着Cmr2的活性，从而控制着免疫反应。该研究通过冷冻电镜技术解析了冰岛硫化叶菌中的Cmr-β复合物与不同底物结合后的七种高分辨率结构，结合生化实验数据表征该III-B CRISPR-Cas系统结合靶标RNA后，颈环结构的构象变化参与机体避免自身免疫以及响应免疫的机制。该研究为全面了解多样性的III型CRISPR-Cas系统的免疫机制提供了参考。
我校生命科学技术学院博士毕业生冯明霞为共同第一作者，佘群新教授和哥本哈根大学蛋白质研究中心Guillermo Montoya教授为该研究的共同通讯作者，Guillermo Montoya组的Nicholas Sofos（博士后）与佘群新教授组冯明霞博士为共同第一作者，我校生命科学技术学院李英俊博士也参与了该工作。
2019年，佘群新教授组与Guillermo Montoya教授组合作还在Nature Communications上发表了题为“Structure of Csx1-cOA4 complex reveals the basis of RNA decay in Type III-B CRISPR-Cas”的研究论文（冯明霞博士为共同第一作者），解析了III-B型CRISPR-Cas系统Csx1-cOA4复合体结构并揭示其切割RNA的机制。
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