新建可预测的多核苷酸删除基因组编辑系统

基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术已经被广泛用于功能基因研究和作物遗传改良，但传统的基因编辑系统对调控DNA序列功能解析及应用仍有局限性。

近日，中国科学院遗传与发育生物学研究所研究员高彩霞团队建立了新型的多核苷酸靶向删除系统（英文名称：APOBEC-Cas9 fusion-induced deletion systems, AFIDs），并成功在水稻和小麦基因组中实现了精准、可预测的多核苷酸删除。相关研究成果于6月30日在线发表在《自然-生物技术》杂志。

植物基因组中有多种多样的调控元件、功能基序以及非编码DNA，例如启动子顺式作用元件、miRNA编码序列、上游开放阅读框序列（uORF）、具有调控功能的基因间区。这些DNA序列在调控基因表达、转录翻译等方面发挥重要作用，也是目前基因功能研究与遗传改良的重点目标区域。

由sgRNA引导的Cas9核酸酶可以在基因组靶位点处产生DNA双链断裂（DSB)，细胞通过非同源末端连接(NHEJ）修复，往往容易形成1~3个核苷酸的插入或缺失突变。然而，这种插入/缺失突变很难有效地破坏调控DNA的功能，然而，经典的CRISPR/Cas9不能有效对上述重要DNA功能元件进行操纵。因此，开发新型、精准、可预测的多核苷酸删除基因组编辑系统对调控DNA序列的功能解析及应用具有十分重要的意义。

高彩霞团队长期致力于植物基因组编辑新技术的研究和开发，本研究中，研究人员基于胞嘧啶脱氨以及碱基切除修复（Base Excision Repair, BER）原理，首次将野生型SpCas9与胞嘧啶脱氨酶APOBEC、尿嘧啶糖基化酶(UDG)以及无嘌呤嘧啶位点裂合酶(AP lyase)组合，建立了新型的多核苷酸靶向删除系统。

研究人员表示，考虑植物细胞本身存在BER体系，他们首先利用高脱氨活性的APOBEC3A脱氨酶构建出3种形式的AFID系统（AFID-1~3），并在水稻和小麦细胞中对多个内源DNA靶点进行测试。结果显示，AFID-3介导的删除效率高达33.1%, 且产生从不同的5’-胞嘧啶到Cas9切割位点间的多核苷酸删除，可预测的删除比例高达30%以上。

接着，研究人员进一步对不同胞嘧啶脱氨酶进行筛选，发现截断的APOBEC3B脱氨酶（A3Bctd）不仅有较高的脱氨活性，同时还具有一个更窄的脱氨窗口。将A3Bctd替换AFID-3系统中的A3A，从而开发出eAFID-3系统。eAFID-3更高效地介导从偏好TC基序的脱氨位点到Cas9 切割位点之间的可预测删除，效率是AFID-3的1.5倍。

此外，研究组利用AFID-3系统靶向水稻OsSWEET14基因启动子上的效应子结合元件，获得了多核苷酸删除的突变体植株，经白叶枯病接种试验发现：相较于1~2 bp的插入缺失，该系统产生的多核苷酸删除水稻突变体对白叶枯病菌的抗性更强。

研究结果表明，AFID系统具有高效、精准、可预测等优势，该系统的建立可为植物基因组调控DNA的功能研究及设计育种提供了一个强有力的基因组编辑工具。

相关论文信息：DOI: 10.1038/s41587-020-0566-4

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