中国水稻研究所种质创新团队利用基因编辑技术创制“铁秆”水稻新种质

我国水稻育种水平在广大科技工作者共同努力下，一直在不断进步。从上世纪五六十年代，我国半矮秆籼稻大面积推广，到上世纪七八十年代三系杂交水稻全面成功配套，推广市场，伴随化肥，农药等化工产品发展，水稻品种栽培产量进一步大幅提高。进入九十年代初期，虽然肥水条件能更好供应，但是当时水稻亲本基本来自半矮秆育种品种组合，普遍株高较矮，且分蘖较多，依赖早期密植，穗数型增产方式，在过多肥水条件下，相反群体中个体之间受光姿态不好，库源不协调；同时，这个时期，大量水稻主产区劳动力向城市转移，密植方式开始转为粗放，轻简式栽培，基本苗数相对这种类型品种也显不足，多重原因导致这个时期水稻品种产量贡献一直徘徊不前【1】。九十年代后期，水稻育种有识之士，袁隆平和周开达先生几乎同时提出了培育穗重型品种【2】，而且周开达先生非常明确地指出，鉴于川稻作区阴雨多湿、云雾多、日照少的生态条件，亚种间重穗型杂交稻育种是取得超高产育种目标的技术路线。之后，中国水稻研究所的李振宇先生率先在杂交粳稻做成了重穗型系列的恢复系—中超123【3】，该品种也极大影响了我们对理想株型的思考。


中超123衍生系

在育种家努力下，21世纪开始以后，一些偏籼型同时有一定籼粳稻亲和的组合被相继培育出来。这些组合表现穗大粒多，单株穗重超过5克以上。当时在市场推广比较有名的分别是袁隆平先生等培育的两优培九【4】，周开达先生等的Ⅱ 优6078【1】，程式华先生等的协优9308【5】，同时一些早籼常规稻，例如中嘉早17【6】，早组14等也表现植株茎秆粗壮，穗大粒大。特别还有一些组合直接推广时标注为“铁秆”水稻，例如安徽省农业科学院水稻研究所的皖稻153【7】，该组合实现矮中求高，穗大粒多，茎秆十分粗壮，数十年来大面积推广生产。可以说，超高产育种计划以来，中国水稻育种方向其实由半矮秆多穗型品种间优势组合已经转向亚种间大穗型，粗秆型品种或者组合，而且随着机械化栽培方式在中国普及，矮秆偏高，穗大粒多且茎秆粗壮抗倒的优质稻米组合和品种也将更加普遍。

我们一直利用两优培九杂交种重组自交系进行杂种优势分析，虽然检测到的43个优势QTLs，但并没有检测到两优培九的粗秆和大穗性状的QTLs【4】。得力于我们长期以9311为受体，日本晴为供体亲本的染色体片段代换系的建成，以茎秆粗度和抗折力为性状指标，我们很快定位了三个分别位于SD1，APO1（SCM2），OsTB1位点附近的QTLs，它们的正向性状分别来自日本晴和9311。非常顺利地，利用构建9311/日本晴的近等基因系结合图位克隆方法，克隆了来自9311对茎秆粗度和抗折力有正向效应的Ostb1等位位点。结合名古屋大学的Matsuoka（松岗信）课题组曾发表的Chugoku117 (中国117) 粗秆品种中同样具有Ostb1正向促进效应的遗传分析结果【8】以及我们初步得到的中超123的定位结果，我们认为，这些粗秆的存在Ostb1是一个半显性突变，并且其异位增强表达集中在幼穗分化阶段，因此具有多效性功能。它不仅促进茎秆变粗，而且能增加穗粒数。不同茎秆粗度的品种序列比较，基因转录水平分析以及转基因实验表明，其实在OsTB1基因上游5’端非编区的TGTG插入突变是改变基因转录水平提高的根本原因。这也提示我们，组成性表达OsTB1基因，虽然能得到植株粗度增加的转基因植株，但由于OsTB1过量表达，会导致发育迟缓，植株变矮，穗型变小，结实很差，其实无法应用于育种和生产。因此，因此，如何利用基因编辑方法，精确设计编辑位点，创造类似自发突变，将不仅能验证OsTB1启动子区不同元件功能，有利于研究非编码区功能分析，而且可以直接创造出生产上有利等位突变种质。

以前的研究已经表明，IPA1，DEP1都可以结合到OsTB1上游区位点【9】。借鉴这些结果和确定TGTG插入突变功能，我们在OsTB1上游区1Kb左右区域设计了6个特定sgRNA, 并整合到一个编辑载体中，转到正常茎秆粗度的日本晴水稻中，获得三种类型的水稻编辑品系。第一种类型是类似编码区突变的fc1失去功能突变体一样，多分蘖，茎秆变细软且矮，穗子短小；第二种与野生型相比，株型变化不大，说明有些突变对OsTB1基因转录影响不大；第三种虽然都是相比野生型茎秆变粗，穗粒数增加，植株变高，但增加的幅度不一样。



三种类型的水稻编辑品系

值得一提的是，编辑得到含有TGTG插入的株系，虽然还有其他2处新的突变产生，但这个插入引起的效应最大，类似自然发生的TGTG插入突变一样，均是很好地使茎秆变粗而且抗折力，同时株高，穗长，穗粒数均有相比野生型十分显著的增加。可见，无论是自发突变，还是Crsipr/Cas9方式创造的双链断裂之后，DNA的修复均是由细胞本身完成的，在这过程中带来的突变形式应该也是类似的。因此，如果我们对现在克隆到一些重要有利突变，重新回头认真做出设计，利用不断改进的基因编辑方法，都有很大机会获得生产证明有用的种质。这不仅会提高育种效率，同时也反过来促进对物种中复杂农艺性状的遗传分析能力。

上述研究最新成果于近日以Production of novel beneficial alleles of a rice yield‐related QTL by CRISPR/Cas9为题发表在Plant Biotechnology Journal上。




参考文献
1. 周开达 & 刘太清. 亚种间重穗型杂交稻研究. 中国农业科学 030, 91-93.
2. 袁隆平. 杂交水稻超高产育种. 杂交水稻.
3. 李振宇. “粳不/籼”配组方式在水稻亚种间杂种优势利用中的重要性. 杂交水稻
4. Gao, Z. Y. et al. Dissecting yield-associated loci in super hybrid rice by resequencing recombinant inbred lines and improving parental genome sequences. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 14492-14497 (2013).
5. 沈希宏 et al. 超级杂交稻协优9308重组自交系的分子遗传图谱构建. 分子植物育种 6, 861-866 (2008).
6. 张应洲 et al. QTL Mapping of Yield Associated Traits of Nipponbare ×Zhongjiazao 17 RIL Population 日本晴/中嘉早17重组自交系产量性状QTL定位. 中国农业科学 050, 3640-3651.
7. 操成波. 铁杆超级稻——皖稻153. 现代农业科学, 7-8 (2007).
8. Yano, K. et al. Isolation of a novel lodging resistance QTL gene involved in strigolactone signaling and its pyramiding with a QTL gene involved in another mechanism. Mol Plant 8, 303-314 (2014).
9. Lu, Z. et al. Genome-wide binding analysis of the transcription activator ideal plant architecture1 reveals a complex network regulating rice plant architecture. Plant Cell 25, 3743-3759 (2013).

论文链接：onlinelibrary.wiley.com/toc/14677652/0/ja

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