基因编辑如何摆脱“脱靶”困扰

CRISPR/Cas9系统的脱靶效应。金双侠供图

金双侠在华中农大作物遗传改良国家重点实验室查看基因编辑的棉花材料。

基因组编辑技术是当前生命科学研究的前沿领域。在多种不同的基因组编辑方法，以CRISPR/Cas9系统最为便捷、高效，应用也最广泛。

但CRISPR技术存在的脱靶效应依旧是影响其能否广泛应用的主要限制因素，如何正确评估、检测脱靶效应，并提出相应的策略降低脱靶效应，是当前基因编辑研究领域的重要研究方向。

近日，华中农业大学棉花遗传改良团队一篇相关综述，系统总结了当前的基因编辑工具、基因编辑产生的脱靶效应及类型、脱靶效应的机理、动植物的脱靶效应存在的问题；并总结了如何进行sgRNA设计，脱靶效应的评估和预测，避免和减轻脱靶效应的策略以及对预期基因组编辑结果的影响。该论文在线发表于国际综合性期刊《先进科学》。

基因编辑虽好，脱靶是个问题

相对于以往研究基因功能的工具，以CRISPR/Cas9 为代表的基因编辑的效率和准确性都较高，但也会带来一个可能“致命”的问题——脱靶效应。

“基因编辑可以‘指哪打哪’。一般只要20个核苷酸序列就能对一个基因进行定位并定点敲除。但同时，在基因组序列中，与特定20个核苷酸序列相近的碱基片段非常多。基因编辑过程中，与导向RNA靶向目标很接近的片段，也会结合上去并被敲除掉，这就是所谓的‘脱靶’。”华中农业大学植物科学技术学院教授、论文共同通讯作者金双侠在接受《中国科学报》采访时解释到。

金双侠强调，由于可以结合的潜在脱靶位点基因片段较短，所以在理论上脱靶概率还是比较高的，脱靶位点也比较多。如果脱靶现象普遍发生，对动植物来说都会是一个严重的挑战，其后果是比较严重的。

在电子科技大学生命科学与技术学院教授张勇看来，基因组编辑技术在动植物育种和基础研究工作中都很重要。但其中的脱靶效应和非特异性剪切对应用结果和研究成果的可靠性、有用性有重要影响。“目前，对于基因编辑技术的应用和发展的综述较多，但全面综述脱靶效应的比较少。”

“长期以来，学术界对植物基因编辑器和基因编辑工具的脱靶效应缺乏相关重视”，安徽省作物基因编辑中心主任、安徽省农科院水稻研究所研究员魏鹏程评价到，该综述很好地结合了动物基因编辑技术中的前沿进展以及植物基因编辑所面临的问题，指出了未来在脱靶效应方面到底应该做哪些工作。

四种脱靶检测方法

根据该论文，基因编辑领域目前可以采用以下策略降低脱靶效应：开发并合理利用预测脱靶效应的有效工具，开发新的基因编辑系统，利用高质量参考基因组设计靶标和好的基因编辑工具递送系统。“这上面几种技术策略的利用，可以有效减少或避免脱靶。”金双侠表示。

脱靶检测最简单有效的方法之一是全基因组测序法。通过软件预测潜在的脱靶位点，然后将基因组测出来进行比对。如果与受体材料相比，在潜在脱靶位点没有变化则证明没有脱靶，有变化则有可能存在脱靶，进一步可以通过经典Sanger测序法进行验证。“这是目前非常简单高效，而且全面的一种方法。”金双侠称。

开发新的基因编辑系统，则是从技术源头的角度去避免脱靶，目前出现了一些新的CRISPR/Cas系统，相比于最常用的CRISPR/Cas 9系统，有更高的精准性可以显著地降低脱靶效应。

由于基因编辑中的基因组是通过基因组测序获得的成千上万的小片段拼接而成，受早期测序技术和拼接策略的局限，很多物种的基因组早期版本有错误，如果对这样的基因组进行编辑，就好比去解读一本错误百出的书本，自然会产生误解。所以，如果没有很好的参考基因组，很容易产生脱靶。

“最理想的状态是，做每一个品种的基因组编辑时，以该品种的参考基因组去做靶标设计。”金双侠表示，即使是同一个物种，不同的品种、品系间都存在相当大的遗传差异，这会对脱靶、基因编辑精准性会产生很大影响。

好的基因编辑工具的传递系统应当尽量避免或者降低组织培养产生的体细胞无性系变异，也是减少脱靶或者是说提高基因编辑精准性的一个重要策略。

基因编辑工具未来前景

张勇认为，该综述对基本概念讲得非常清楚，对方法的综述非常全面。同时也非常贴近研究工作的实际，“不是从理论到理论的、读完别人工作后做的文献综述，而是结合了第一线的工作。”

“该综述通过总结现有研究工作，梳理了脱靶效应这一概念的历史，对脱靶效应的概念进行了比较系统和全面的分类。在方法层面比较全面系统阐述了怎样从实验角度，用不同基因编辑技术检测脱靶效应的效率及可行性；用生物信息学、AI数据分析等预测评估脱靶效应；怎样降低脱靶效应提高基因编辑的准确性等问题。”张勇表示。

目前，基因编辑最主流的三种工具分别是锌指核酸酶（ZFN）技术，转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）技术和串联间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas）系统，其中以CRISPR/Cas最高效、应用最多，但其脱靶率相对来说也最高。在准确性方面，TELEN的表现最好。

上世纪90年代开始，生物界已经开始运用ZFN技术。2000年之后出现TALEN技术。“早期的基因编辑技术都是蛋白质递层，也就是说要把蛋白质递到细胞里来，释放蛋白质的过程消耗的能量是非常大的。”魏鹏程表示，虽然TALEN技术目前来看在保真性和精确程度上比CRISPR/Cas强，但从所消耗的能量和构建药品的成本上看，CRISPR/Cas应是基因编辑技术以后发展的一个重点。

金双侠也认为，虽然三种主流工具的应用目前处于优势互补状态，有的科研机构会同时使用这三种工具。未来还是CRISPR/Cas更有发展潜力。

“CRISPR/Cas基因编辑工具目前所面临的保真性和精确程度不足的问题，在后续发展中应该可以得到克服。”魏鹏程据此判断的理由是，早期的CRISPR蛋白主要从自然生物中去筛选，并没有根据需要进行人工选择，因此能承受一部分的脱靶效应。一旦把人工选择加进去之后，保真性很容易进化出来。“将来的发展趋势会是CRISPR/Cas技术的日臻完善，会把它现有的一些问题，比如保真性方面的缺陷给它弥补上。” （韩天琪）

相关论文信息：https://doi.org/10.1002/advs.201902312

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