刘耀光院士中文综述CRISPR/Cas 植物基因组编辑技术研究进展！

摘要: 基因编辑技术的发展与应用为植物功能基因研究和作物遗传改良提供了重要的技术支撑。近年诞生的CRISPR/Cas 基因编辑系统 (主要包括 CRISPR/Cas9 和 CRISPR/Cas12a) 与其他的基因编辑技术相比，具有操作简 单、效率高等优势，因此在动植物中均得到广泛应用。本文结合 CRISPR/Cas 基因编辑技术体系的发展历史及最新 研究进展，着重介绍了该技术在植物领域中的应用范围和发展方向，以及基因编辑植物的靶点分析方法；对目前 CRISPR/Cas 基因编辑技术体系存在的问题进行了分析并提出了改进策略。

基因功能的鉴定和作物新品种的选育离不开 突变体的获得，之前突变体的获得主要依靠自然突 变、物理或化学诱变以及T-DNA 随机插入等手段[1]。这些方法存在突变效率低、突变位点随机等缺陷，且后续还需要通过图位克隆等耗时耗力的技术手段才能最终确定突变基因。因此，在特定的位点引入核苷酸变异，实现基因的定点编辑能高效地获得目标突变体，从而加快基础研究和遗传育种的进程。基因编辑技术主要是利用序列特异性核酸酶 (Sequence specific nucleases, SSNs) 在特定基因位点产生 DNA 双链断裂，借助编辑受体自身的 DNA 修复系统在非同源末端连接 (Non-homologous end joining, NHEJ) 过程中产生随机的 Indels(Small insertions and deletions) 或在同源重组修复过程中 插入或替换相应的基因片段，最终实现基因组序列 的突变。现有的基因编辑系统主要包括锌指核酸酶 (Zinc finger nucleases, ZFNs) 系统、类转录激活因子效应物核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases, TALENs) 系统以及 CRISPR/Cas (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein) 系统[2] ，其中，CRISPR/ Cas 系统由于载体构建过程简单、编辑效率高等优 点，成为当前广泛应用的主流基因编辑系统。本文回顾了CRISPR/Cas系统的发现和编辑技术体系建 立的历程，介绍了CRISPR/Cas 编辑技术在植物中的应用以及编辑结果的分析方法，并展望了 CRISPR/ Cas 基因编辑技术以及编辑靶点分析技术的发展趋势。

1 CRISPR/Cas 免疫系统的作用机制和分类

科学家们对 CRISPR/Cas 免疫系统的研究早在 30 年前就已经开始。1987 年，日本研究团队在研究大肠埃希菌 Escherichia coli 碱性磷酸酶的同工酶基因 iap 的时候发现，在该基因的 3＇端存在特殊的侧翼结构，即 29 bp 的高度相似序列分别被 32 bp 序列间隔，形成了 5 个拷贝的串联重复序列[3]。但该团队并未对此现象进行更深入的研究。Mojica 等[4-5] 对此产生了浓厚的兴趣，他们利用生物信息学检索探究，在 20 多种微生物中都发现了类似的短 序列重复结构，并将这种短序列重复结构命名为规则的短间隔重复 (Short regularly spaced repeats， SRSRs)；提出 SRSRs 可能存在于原核生物基因组， 包括所有嗜热细菌和古细菌中以及部分的蓝藻和变形菌门生物；总结了 SRSRs 的基本特征：24~ 40 bp 的短回文序列 (回文区可达 11 bp) 成簇存在， 并被非重复的 20~58 bp 序列间隔开来。2002 年，为了更贴切地表示 SRSRs 的特征以及避免命名的混乱，Jansen 与 Mojica 商定将 SRSRs 更名为成簇有规律的间隔短回文重复序列 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)。Jansen 等[6] 发现大部分种类的原核生物具有 2 个或 2 个以上的 CRISPR 基因座前导序列，而这些 CRISPR 基因座前端共享一个 300~500 bp 的种间 保守前导序列，并通过比较 CRISPR 基因座侧翼的基因组信息，鉴定出不同原核生物中高度相似的 4 个 CRISPR 关联基因：Cas1~Cas4。2005 年，Mojica 等[7] 再次发表了对 CRISPR/Cas 系统研究的最新结 果，他发现 CRISPR 中的间隔序列大部分来自噬菌 体或接合质粒，并且携带某一噬菌体片段的细菌具 有对相应噬菌体的抵抗力；CRISPR 基因座存储了病原菌的基因信息，可能是微生物适应性免疫系统 的一部分。随后，另有 2 个科研团队也发表了相近 结果的论文[8-9]。2007 年，Barrangou 等[10] 证明了在 噬菌体攻击后，筛选到的抗性细菌的 CRISPR 区整 合了新的间隔序列，而间隔序列正是来源于噬菌体 DNA，也就是说，细菌通过识别与噬菌体序列相同 的 CRISPR 间隔区对应的特定序列，获得对噬菌体 的抗性，产生适应性免疫能力；还确认了 CRISPR 关联基因 Cas7 帮助细菌获得新的间隔序列和重 复，Cas9 则发挥了核酸切割酶的作用，为细菌免疫 系统所必需。随后的几年，CRISPR 细菌免疫系统 的必要条件和作用机制相继被发现和证实，如 CRISPR 中依靠重复序列形成的 crRNA 是 CRISPR 产生抵抗力的关键[11] ，Cas9 切割的对象是 DNA[12] ， 且对 DNA 的精准切割的位点与 crRNA 特定序列 和 PAM(Proto-spacer adjacent motif) 序列有关[13-14] ， Ⅱ型系统中 tracrRNA 也参与了 Cas9 的切割[15] 等等。

CRISPR/Cas 系统广泛分布于 90% 的古细菌 及 50% 的细菌基因组或质粒上[16]。它由 CRISPR 基因座和 Cas 基因 2 部分组成，其中，CRISPR 基因 座又包括位于 CRISPR 基因座上游富含 AT 碱基的 前导序列 (Leader)、涵盖回文序列的 20~50 bp 的重 复序列 (Repeat) 和从外源捕获的间隔序列 (Spacer)。CRISPR/Cas 系统的免疫过程分为 3 个阶段[17] ：1) 外 源 DNA 首次入侵时，细菌进入适应阶段，来源于噬 菌体或质粒上的前间隔序列 (Protospacer) 的 DNA 同源短片段被整合到 CRISPR 基因座前导序列下游 中，形成新的间隔序列；2) 外源 DNA 再次入侵时， 细菌激活了表达阶段，CRISPR 基因座转录出前体 crRNA，由内切核糖核酸酶催化加工成成熟的 crRNA；3) 在干扰阶段，成熟的 crRNA 引导 Cas 蛋 白复合物靶向噬菌体前间隔序列位置，识别噬菌体 基因组内的 PAM 序列，对外源靶标位置精准切割 从而避免细菌切割自身 CRISPR 基因座。

2012 年，Jinek 等[15] 在《Science》上发表研究成 果，证明了crRNAs(CRISPR RNAs) 与反式作用 crRNA(Trans-activating crRNA，tracrRNA) 配对结合后形成双分子的 RNA 结构，可以介导 Cas9 蛋白定 向切割 DNA 序列。2013 年，张峰团队率先利用 CRISPR/Cas9 技术在人类和小鼠细胞内实现了精准 的基因编辑，并构建了可同时靶向多个位点的基因 编辑系统[18]。此后，CRISPR/Cas 基因编辑技术蓬勃发展。

Makarov 等[17, 19] 根据 Cas 基因的数目和功能 将 CRISPR/Cas 系统分为了 2 大类 5 种类型 (Ⅰ~Ⅴ)16 种亚型，其中，Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型属于第 1 类，它们在 干扰靶基因时需要多个 Cas 蛋白形成复合物协同 工作；Ⅱ和Ⅴ型属于第 2 类，它们利用单一 Cas 蛋白就能够干扰靶基因。第 2 类Ⅱ型系统较为简单，研究也更加透彻，目前应用较广的 CRISPR/Cas9 系统为Ⅱ型 CRISPR 系统，而新兴的 CRISPR/Cas12a (Cpf1) 系统属于Ⅴ型 CRISPR 系统。Shmakov 等[20] 2015 年又发现了Ⅵ和Ⅴ型的 2 种亚型。

2 CRISPR 基因编辑系统的建立

在对细菌的 CRISPR/Cas 免疫系统及作用机理有了较深的认识后，科学家们开始对该系统进行改 造并应用于动植物的基因组编辑。目前应用最广泛 的 CRISPR 基因编辑系统主要包括 CRISPR/Cas9 系统和 CRISPR/Cas12a 系统。

2.1 CRISPR/Cas9 系统的建立

CRISPR/Cas9 是目前报道的唯一被优先应用于基因编辑的Ⅱ型系统。与Ⅰ和Ⅲ型 CRISPR 系统需 要多个 Cas 蛋白形成复合物共同发挥功能的机制不同，Ⅱ型 CRISPR 系统仅需 1 个 Cas 蛋白和 2 个 RNA 元件即可实现对靶 DNA 的切割[15]。为了进一 步简化 CRISPR/Cas9 系统，研究者通过保留必需元件 tracrRNA 和 crRNA 的核心序列并引入连接区， 将两者合并为一个 sgRNA(Single guide RNA)，并通过体外试验证实 Cas9 蛋白能在 sgRNA 的引导下切割双链 DNA，这一系列成果为 CRISPR/Cas9 在基因编辑中的广泛应用奠定了坚实基础。自 2013 年起，利用 CRISPR/Cas9 技术相继实现了对人类细 胞、小鼠细胞、斑马鱼、果蝇、水稻、拟南芥等真核系统中的内源基因组编辑[21-30]。

CRISPR/Cas9 基因编辑技术主要包括两大核心内容：1) 构建 Cas9/sgRNA 表达载体，将载体导入受 体细胞表达发挥编辑作用；2) 将表达纯化的 Cas9 蛋白与合成的 sgRNA 导入受体细胞发挥编辑作用。来源于链球菌 Streptococcus pyogenes 的 Cas9 蛋白 SpCas9 最先被应用于基因编辑，该蛋白含有一个 RuvC-like 结构域和一个 HNH 核酸酶结构域，两者分别在靶 DNA 的 PAM 序列“NGG” 上游 3 nt 处对 DNA 双链进行切割，形成平末端。在真核系统中，需要在 Cas9 蛋白中添加一段核定位信号以保证该蛋白进入细胞核正常发挥功能。sgRNA 是一段具有特定结构的单链 RNA，其 5＇端 约 2 0 个碱基与靶 D N A 互补配对结合，引导 Cas9/sgRNA 复合物对相应位点进行切割，决定编辑位点特异性。因此，在构建 Cas9/sgRNA 表达载体编辑受体基因组中不同的位点时，只须改变 sgRNA 中 5＇端的特异位点识别序列，而其他元件可保持不变，极大地降低了载体构建的技术门槛。此外，通过构建多个 sgRNA 表达盒的串联载体，可 实现同时对多个靶位点的有效编辑，显著地提高了该系统的编辑效率。在 Cas9/sgRNA 表达载体构建完成后，需要通过多种转化手段将表达元件或 Cas9/sgRNA 产物导入到编辑受体中发挥功能。在植物系统中，将 Cas9/sgRNA表达载体导入植物细胞的有效方法包括原生质体PEG 转染、农杆菌叶片注射法、基因枪轰击、农杆菌介导转化等，不同方法在不同植物中的编辑效率各异[31-33]。在此基础上， 不同实验室针对植物系统影响编辑效率的关键因素如 sgRNA 序列、启动子选择、Cas9 变体或同源蛋白的选择等进行了一系列探索和优化[31, 33-35]。

2.2 CRISPR/Cas12a 系统的建立

虽然 CRISPR/Cas9 被广泛应用，但该系统仍存 在编辑位点受限、脱靶情况较多等缺陷，因此开发 与建立新的 CRISPR 基因编辑系统是科学家们研究 的热点之一。CRISPR/Cas12a 属于Ⅴ型 CRISPR/ Cas 系统，它同样只需一个 Cas 蛋白即可对双链 DNA 进行切割，但其作用元件和作用模式与 CRISPR/ Cas9 截然不同[36]。首先，仅携带 RuvC-like 结构域的 Cas12a 在 crRNA 引导下即可切割双链 DNA，不 需要 tracrRNA 的参与；其次，C12a 特异识别富含 T 的 PAM 序列；最后，Cas12a 在靶 DNA 的 PAM 序列下游 18 nt 处 (正链) 和 23 nt 处 (负链) 对 DNA 双链进行切割，形成黏性末端。与 CRISPR/Cas9 相 比，该系统具有如下独特优势[ 3 7 - 3 8 ] ：1)CRISPR/ Cas12a 系统的 crRNA 比 sgRNA 更短，且 Cas12a 蛋白也比 Cas9 蛋白更小，因此，CRISPR/Cas12a 适用于更多装载量小的载体系统，特别是多靶点编辑 的情况；2)Cas12a 切割 DNA 后形成黏性末端，增 加了HDR 修复途径发生的概率，有利于 DNA 片段 的定点插入和替换；3) 在多个物种的基因编辑中， CRISPR/Cas12a 表现出更低的脱靶率。

目前，CRISPR/Cas12a 在基因编辑中的应用仍局限于少数物种，植物的研究大部分集中在水稻系 统[39-46] 以及少数烟草、拟南芥、大豆和玉米等系统 的报道[39, 42, 46-47]。这可能是因为 CRISPR/Cas12a 在 低温条件下编辑效率低[46] ，且较严格的 PAM 序列 “TTTV”降低了该系统的编辑范围。基于其自身的 优点及局限性，CRISPR/Cas12a 成为了继 CRISPR/Cas9 后第 2 个被广泛关注的基因编辑系统，两者互为补 充，进一步丰富了基因组编辑系统选择的多样性。

3 CRISPR/Cas9 在植物基因组编辑中的应用

目前 CRISPR/Cas9 在植物基因组编辑中的应用主要包括基因功能研究和作物遗传改良，编辑形 式可分为功能基因的敲除、基因 (片段) 的定点插入或替换、单碱基编辑和基因表达调控 4 个方面。

3.1 功能基因的敲除

利用 CRISPR/Cas9 对功能基因进行特异敲除是目前该系统在植物中应用最广泛的方向。这是由 于 Cas9 蛋白切割目标 DNA 形成双链断裂后，往往会优先启动编辑受体中的 NHEJ 易错修复途径，大 多数情况下可以在切割位点附近产生碱基并插入缺失 (Indel)，且大部分是 1 bp 的插入、小部分为短 片段缺失[48-49]。当产生的 Indel 位于基因外显子且 碱基数不是 3 的倍数时，便会造成密码子的移码突 变。对于二倍体植物如水稻，由 CRISPR/Cas9 产生 、突变的效率能达到 80% 以上[50]。当 2 个等位基因 同时被编辑产生双等位突变或纯合突变时，便能实现基因的敲除。对于多倍体植物，所有等位基因同 、时被编辑的概率偏低，因此多倍体植物特别是小麦、土豆等农作物的高效编辑体系构建仍是当前研 究的难点[51-52]。

基于 CRISPR/Cas9 系统介导基因敲除的高效性，多基因编辑技术随即诞生。多基因编辑主要有 2 条途径：1) 对多个同源基因同时进行敲除，此时只需以它们的保守序列作为靶点，设计一条 sgRNA 即可敲除多个基因，但该方法使用范围受限；2) 对不 同基因设计针对不同靶点的 sgRNA，将多个 sgRNA 表达盒连接到表达载体并导入编辑受体，如在水稻 中能实现 7 个基因的同时敲除[49]。这种多靶点编辑 技术特别适用于功能冗余基因、基因家族和同一生 化途径中多个基因的功能研究，以及农作物中多个 农艺性状的改良。此外，多靶点编辑技术还能通过在 基因片段两侧各设计一个靶点，实现片段的删除。目 前利用该方法可成功删除大于 100 kb 的染色体片段，而对于 1 kb 以内 (特别是<100 bp)的小片段则拥 有较高的删除效率[53-55]。片段删除法可以对基因进 行更彻底的敲除，特别是针对非编码基因，也可用于特定结构域的功能分析。已有大量研究通过对水稻的已知基因进行 CRISPR 编辑敲除从而快速获得具有高抗、高产、高品质等优良性状的植株 (表 1)。