华中农大棉花团队建立四倍体棉花CRISPR-Cpf1高效基因编辑系统...

CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种免疫系统，被用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。然而，目前的9系统会产生脱靶效应，导致一些不理想的结果。之后，一种新型的Cas蛋白（Cas12a/Cpf1）的出现扩展了基因编辑所依赖的Cas蛋白的种类，这个新型蛋白与之前CRISPR／Cas9基因编辑系统相比，具有编辑过程简单，分子量小，更特异的PAM序列，剪切位置不同，产生粘性末端及脱靶效率低等优点，因此，由它介导的CRISPR-cas12a系统作为一类新型的基因编辑工具，在植物的基因编辑中广泛引起人们的关注。

2019年5月5日，Plant Biotechnology Journal 杂志在线发表了华中农业大学棉花遗传改良团队题为“Robust CRISPR/Cpf1（Cas12a）mediated genome editing in allotetraploid cotton（G.hirsutum）”的研究论文，该论文分析了Cpf1（Cas12a）蛋白在棉花异源四倍体中的编辑作用，具有很高的编辑效率，并且没有发现脱靶效应。

值得注意的是这是华中农大棉花团队发表的第三篇关于棉花基因编辑的研究论文，前两篇论文分别是：2017年发表的“High efficient multi-sites genome editing in allotetraploid cotton(Gossypium hirsutum) using CRISPR/Cas9 system”以及2018年发表的“Whole genome sequencing reveals rare off-target mutations and considerable inherent genetic or/and somaclonal variations in CRISPR/Cas9-edited cotton plants”。

棉花是我国重要的经济作物之一，是天然纤维，植物蛋白的重要来源。目前种植最多的异源四倍体棉花因其庞大而复杂的基因组，大多数基因在At和Dt亚基因组多个同源拷贝，给棉花基因组功能研究带来巨大挑战。2017年，华中农业大学棉花遗传改良团队开发了在棉花异源四倍体中具有高效编辑效率的以CRISPR/Cas9载体，并且能够稳定的遗传转化。为了在棉花中进一步开发效率更高，特异性更强的基因编辑载体，该团队构建了以Cpf1（Cas12a）蛋白为工具的编辑载体，并在棉花中进行了一系列的验证。

该研究以棉花内源叶绿体形成相关基因（GhCLA）为靶标，通过tRNA-sgRNA转录单元构建了基因编辑载体，通过农杆菌介导的转化获得了含LbCpf1质粒载体的92株独立的T0代再生植株。通过Sanger测序和高通量测序（Hi-Tom）检测产生的转基因植株的突变。Sanger测序结果显示，92株T0独立植株中有80株（有效率87%）在目标位点检测到突变，另一方面，Hi-TOM数据显示，每个单独的植物包含不同的编辑程度。表明LbCpf1在棉花植株中具有较强的编辑活性。在所有被编辑的植株中，突变程度在1~94.12%之间，其中在At和Dt亚基因组同时编辑的有编辑68个样本，仅At或Dt亚基因组编辑6个样本；作者根据sgRNAcas9_3.0.5软件确定了最具潜力的六个脱靶位点，利用T1植物的位点特异性PCR产物进行Sanger测序，检测这些潜在的脱靶位点后并未检测到脱靶效应；同时发现CRISPR/Cpf1系统在棉花中更倾向于在目标位点诱导DNA缺失，而不是碱基替换或插入。因此，在棉花基因组编辑中，CRISPR/Cpf1系统更倾向于产生大规模缺失，说明LbCpf1系统特异性强，是棉花基因组编辑的良好选择。

华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室金双侠教授为该论文的通讯作者，博士生李波和已毕业的硕士芮杭萍为共同第一作者，张献龙教授也参与了这项工作。该研究受到国家重点研发计划（2016YFD0100203-9）和国家科技部转基因专项（2018ZX08010-05B）和中央高校科研经费（2013PY064,2662015PY028，2662015PY091和0900206328）的支持。