Nature Biotechnology | 一种加快育种进程的新策略—HI-Edit，适用广、时间短

近年发展起来的基因编辑技术有望从根本上改变农作物的选育策略，然而由于基因型的限制等原因，现阶段能够通过遗传操作直接改良的商业化品种少之又少【1, 2】。因此需要先选用合适的基因型材料进行遗传修饰后作为亲本通过杂交、多世代回交加分子标记辅助选择的方法将目的基因导入到商业化品种中，整个过程费时费力。

单倍体诱导（haploid induction, HI）技术可在短时间内将作物的基因型固定下来，在农作物育种实践中具有重要意义。在遗传作图、数量现状分析等领域常用的稳定自交系往往需要多达6个世代的连续自交才能获取，而如果利用HI技术先获得单倍体后进行染色体加倍即可在短时间内获得纯合的候选材料【3】。玉米、小麦、大麦、烟草等作物中的自然存在的单倍体诱导体系已经获得了广泛的应用【4-7】。通过对CENTROMERIC HISTONE3 (CENH3)进行适当的修饰或者敲除水稻、玉米中的MATRILINEAL (MATL)也可使获得的材料具有诱导单倍体产生的特性【8-13】。在之前的研究中，中国水稻研究所王克剑团队通过同时对水稻中的MATL以及PAIR1，REC8 和OSD1 进行编辑，获得了可以进行无融合生殖株系，使杂合背景的基因型的固定与遗传成为可能【13】。

近日，来自先正达公司的科研人员提出了名为HI-Edit的新策略，即将单倍体诱导育种与基因编辑技术结合起来，从而在短时间内即可完成对已商业化的品种进行直接改良。相关研究成果以One-step genome editing of elite crop germplasm during haploid induction为题于2019年3月4日发表在Nature Biotechnology杂志上。



首先，研究人员检验了利用matl 的花粉对商业化的自交种质进行编辑的可能性：（1）利用CRISPR–Cas9技术获得了敲除玉米非单倍体诱导自交系NP2222中MATL 的稳定转化植株；（2）选择纯合matl 且携带有Cas9 的植株与具有叶色形态标记的自交系B14-v1进行杂交；（3）从95个后代植株中筛选得到了3个不含Cas9、且ZmMATL 被敲除的株系；（4）利用流式细胞仪对上述3个株系进行DNA定量分析表明它们全为单倍体；（5）用75个NP2222与B14-v1间的SNP标记分析表明所获得3个株系不含有任何来自NP2222的遗传物质。该研究表明，可利用父本来源的matl 突变可完成商业化种质特定位点的修改（流程见图1）。


图1. 利用HI-Edit策略获得理想DH系的流程图

其次，为验证HI-Edit策略用于作物改良的可能性，研究人员选择了与玉米籽粒数量和重量相关的几个基因（VLHP1, VLHP2, ZmGW2-1, ZmGW2-2）用于验证。首先，构建了相应基因的CRISPR–Cas9载体并导入到非单倍体诱导自交系NP2222中以获得稳定转化植株；选择携带有Cas9的株系与自然的单倍体诱导系RWKS进行杂交，从F2中选择携带有Cas9和纯合matl 突变的个体与各玉米自交系再次杂交，通过RWKS特有的籽粒颜色标记筛选出单倍体并通过胚拯救的方法获得植株（具体效率请见图2）。此外,田间实验表明ZmVLHPs 和ZmGW2s 经过编辑后的植株与CJ7031杂交后代的玉米籽粒数量和重量分别显著高于对照。


图2. 利用HI-Edit策略获得ZmVLHPs 或ZmGW2s 突变的单倍体流程图

第三，研究人员开发出了CENH3 HI-Edit系统用于双子叶植物的改良。第一步，他们用ZmCENH3 替换Col生态型拟南芥基因组中原有的AtCENH3 使其获得了约10%的单倍体产生效率，将Cas9-AtGL1 载体导入该基因型与Ler生态型拟南芥杂交，后代中有1.6%的子代为纯合无表皮毛（gl1）的Ler型单倍体，表明了该技术适用与双子叶植物中的基因编辑（图3）。


图3. 利用CENH3 HI-Edit系统获得拟南芥gl1 突变的单倍体

第四，研究人员利用HI-Edit系统与属间杂交结合的方式成功对小麦中的基因实现了编辑。将携带有Cas9-TaGT1s 载体的玉米转基因植株的花粉授予到被去雄的小麦品种AC Nanda或者胞质雄性不育系（CMS）植株的柱头上，通过胚拯救的方式获得单倍体植株并进行基因型分析，从292个CMS来源的单倍体中发现有2个株系的基因被敲除（图4）。进一步研究发现，将驱动Cas9表达的启动子更换为花粉特异的启动子后可以显著提高实现基因编辑的效率。


图4. 利用HI-Edit体系和属间远缘杂交编辑小麦基因

HI-Edit策略的优势：
1. 可通过杂交将修饰过的目的基因导入到大多数品种中，包括已商业化的优势品种，弥补现有基因编辑体系受物种和基因型的限制；
2. 因为携带基因编辑元件的供体通过单倍体诱导系导入到商业化品种中，其染色体在杂交过程中会被清除，因此获得的杂交种不会含有该父本的遗传信息，不需要多次回交，只需要对目的单倍体植株进行染色体加倍即可获得改良的DH品系，大大缩短育种周期；
3. 该技术在单子叶、双子叶植物的基因编辑中均获得成功；与人工诱导单倍体技术结合进一步拓展了其适用范围，还可通过远缘杂交改良目标作物，适用范围广泛。
4. 可获得transgene-free的株系，满足政策许可。

此外，该研究还有以下重要的科学意义：
1. 长期存在争论的玉米单倍体形成机制提供了直接证据，表明玉米单倍体是在受精以后来自父本的基因组被清除而后形成的，而不是由未受精的卵细胞通过孤雌生殖形成的。
2. 为提高基因编辑的效率提供了更多的具有实用价值的信息。

参考文献：
【1】Bortesi, L. & Fischer, R. Te CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnol. Adv. 33, 41–52 (2015).
【2】Lowe, K. et al. Morphogenic regulators Baby Boom and Wuschel improve monocot transformation. Plant Cell 28, 1998–2015 (2016)
【3】Chang, M.-T. & Coe, E. in Molecular Genetics Approaches to Maize Improvement (eds Kriz, A. L. & Larkins, B. A.) 127–142 (Springer, Heidelberg, 2009)
【4】Laurie, D. A. & Bennett, M. D. Te production of haploid wheat plants from wheat × maize crosses. Teor. Appl. Genet. 76, 393–397 (1988).
【5】Coe, E. H. A line of maize with high haploid frequency. Am. Nat. 93, 381–382 (1959).
【6】Kasha, K. J. & Kao, K. N. High frequency haploid production in barley (Hordeum vulgare L.). Nature 225, 874–876 (1970).
【7】Burke, L. G. et al. Maternal haploids of Nicotiana tabacum L. from seed. Science 206, 585 (1979)
【8】Ravi, M. & Chan, S. W. L. Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination. Nature 464, 615–618 (2010)
【9】Kelliher, T. et al. MATRILINEAL, a sperm-specifc phospholipase, triggers maize haploid induction. Nature 542, 105–109 (2017).
【10】Yao et al. OsMATL mutation induces haploid seed formation in indica rice. Nat. Plants 4, 530–533 (2018).
【11】Gilles, L. M. et al. Loss of pollen-specifc phospholipase NOT LIKE DAD triggers gynogenesis in maize. EMBO J. 36, 707–717 (2017).
【12】Liu, C. et al. A 4-bp insertion at ZmPLA1 encoding a putative phospholipase A generates haploid induction in maize. Mol. Plant 10, 520–522 (2017).
【13】Wang, C. et al. Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization genes. Nat Biotechnol. doi: 10.1038/s41587-018-0003-0 (2019).

论文原文链接：doi.org/10.1038/s41587-019-0038-x

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