专家点评Science | 中科院遗传发育所高彩霞组首次在植物中发现单碱基编辑系统存在严重脱靶效应

编者按：新一代基因编辑工具CRISPR/Cas9因具有高效性和高特异性备受关注，CRISPR/Cas9及其衍生工具也被认为能为人类健康和作物遗传改良做出巨大贡献。CRISPR/Cas9衍生工具单碱基编辑器的开发为定向编辑提供了重要工具，然而像其它基因编辑工具一样，其脱靶风险一直备受关注。之前检测脱靶的方案主要依赖于体外实验研究或者对利用生物信息学软件预测，然而，这些方法都存在一些局限性，不能充分检测到脱靶突变。2019年3月1日，Science 发表了两篇来自中国科学家的论文，报道了动、植物单碱基编辑脱靶及检测方法研究的最新进展。一篇来自中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组题题为Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice 的论文；另一篇是来自中科院神经所杨辉研究组题为Cytosine base editor generates substantial off-target single nucleotide variants in mouse embryos的论文。为让读者更深入的了解单碱基编辑脱靶研究的这项最新进展，我们邀请了中国水稻研究所王克剑研究员和华东师范大学李大力教授对相关工作进行了点评，以飨读者！

论文介绍



人类遗传疾病和农作物农艺性状经常是由基因组中的单个或少数核苷酸的突变引起的【1，2】。因此，基因组中关键核苷酸变异的鉴定与定向修正是人类遗传疾病治疗及动植物育种的重要方向。基因组编辑工具单碱基编辑器的开发，为定向编辑和修正基因组中的关键核苷酸变异提供了重要工具，展现了其在遗传疾病治疗与动植物新品种培育等方面潜在的重大应用价值。

单碱基编辑器主要分为两类，胞嘧啶单碱基编辑器(cytosine base editor, CBE)与腺嘌呤单碱基编辑器(adenine base editor, ABE)，分别由胞嘧啶脱氨酶或改造的腺嘌呤脱氨酶与nCas9蛋白融合而来，对应地可在基因组中的靶向位点实现C>T或A>G的碱基编辑【3-6】。目前，CBE与ABE已在多个物种中得到了广泛应用。然而，对它们脱靶效应的检测还很不充分，数据大多数主要来源于体外实验研究或者对利用生物信息学软件预测的有限的靶序列相似位点的检测，CBE与ABE在体内全基因组范围的脱靶效应还未得到评估。

在这项研究中，高彩霞研究团队在水稻中对BE3 (基于融合rAPOBEC1胞嘧啶脱氨酶的CBE系统)，HF1-BE3（高保真版本BE3）与ABE单碱基编辑系统的特异性进行了全基因组水平评估，首次在体内利用全基因组测序技术全面分析和比较了这三种单碱基编辑系统在基因组水平上的脱靶效应。


利用BE3, HF1-BE3和 ABE三种单碱基编辑系统编辑水稻

研究人员该对经过不同单碱基编辑系统转化的的56棵T0代水稻植株与21株对照植株进行全基因组测序。序列统计分析发现，经过单碱基编辑系统处理后，基因组内的插入或删除（indels）突变的数量与对照组相比没有显著变化，但是BE3与HF1-BE3，无论是在有无sgRNA的情况下，均可在水稻基因组中造成大量的单核苷酸变异(SNVs)，且大部分为C>T类型的碱基突变。与经过农杆菌转化但不含任何碱基编辑系统的对照植株相比，BE3系统和HF1-BE3系统处理的植株在基因组范围内的C>T SNVs分别增加了94.5%和231.9%，额外产生了98个C>T SNVs和242个C>T SNVs。重要的是，与Cas-OFFinder软件预测结果比较发现，这些额外增加的C>T SNVs绝大多数发生在不是现有软件可以预测到的脱靶位点。此外，这些C>T变异在染色体间均匀分布，但呈现出在转录活跃区富集的趋势。这些区域倾向于释放单链DNA为胞嘧啶脱氨酶提供合适的底物。研究还发现，与CBE系统相反，ABE系统表现出非常高的特异性。ABE处理的植株与对照植株在全基因组范围内的SNV数量基本一致。


BE3, HF1-BE3和 ABE编辑的水稻中C>T SNVs在基因组上的分布情况



总的来说，现有的BE3和HF1-BE3系统，而非ABE系统，可在植物体内造成难以预测的脱靶突变，因此，需要进一步优化提高特异性。该工作创新性地利用相似遗传背景的克隆植物及全基因组重测序解决了以前大量异质细胞序列分析的复杂性。

高彩霞研究组博士生靳帅、宗媛以及梁承志研究组工作人员高强为本文的共同第一作者，高彩霞研究员为本文的通讯作者。中科院遗传发育所梁承志研究员、王道文研究员，微生物所邱金龙研究员、四川农业大学钦鹏博士和明尼苏达大学张峰博士也参与该研究。该研究得到了国家自然科学基金委，国家重点研发计划与中国科学院项目经费的资助。

专家点评

王克剑 研究员 （中国水稻研究所）

单碱基编辑工具（Base editor）是在CRISPR系统上开发的新型定点突变技术，不需要产生DNA双链断裂（DSB）及额外提供DNA模板就可以对基因组特定碱基进行高效的替换，对某些遗传疾病的定点治疗及农作物性状的定向改良具有重要意义。脱靶效应是评价基因组编辑工具是否精准的重要指标之一。虽然目前已经发展了多个单碱基编辑工具，但是目前尚没有对这些编辑工具在全基因组水平上的脱靶效应进行系统研究。中国科学院遗传与发育生物学高彩霞课题组以水稻为研究对象，对利用胞嘧啶单碱基编辑工具 (cytosine base editor, CBE) BE3和HF1-BE3及腺嘌呤单碱基编辑工具 (adenine base editor, ABE) 进行基因组编辑产生的水稻植株进行了全基因组测序和脱靶编辑分析，发现BE3和HF1-BE3会引入大量的脱靶突变，其中很多脱靶事件发生在转录基因区域，且脱靶位置序列与设计的引导序列无明显相似性，因此不能够通过现有的脱靶预测软件进行准确预测。研究同时发现：利用ABE腺嘌呤编辑工具进行单碱基编辑时，没有检测到明显的脱靶突变现象。研究表明：与BE3和HF1-BE3胞嘧啶编辑工具相比，ABE腺嘌呤编辑工具更适合被用于精准的单碱基编辑。该研究明确了不同单碱基编辑工具的脱靶特性，对单碱基编辑工具的应用和选择具有重要的指导意义。如何降低或消除BE3和HF1-BE3胞嘧啶单碱基编辑工具的脱靶突变，将其优化为更加精准的单碱基编辑工具将是未来基因组编辑领域的重要研究方向之一。

李大力 教授 （华东师范大学生命科学学院）

单碱基编辑工具CBE、ABE自诞生以来就备受基因编辑领域的关注。一方面因为它们不需要产生双链DNA断裂（DSB）就能够进行碱基突变，从这一点上讲它们可能比CRISPR/Cas9系统更为安全。而另一方面也是因为至今还没有一个很好的方法从全基因组的角度来研究单碱基编辑系统在体内产生的脱靶情况。由于生物体和细胞系在生长或增值过程中可能累计大量的自发突变，这些突变以单核苷酸的异质性（SNV）为主，所以很难区分哪些突变是自发产生而哪些是由于CBE、ABE进入细胞后造成的脱靶突变。

近日，中科院神经所杨辉课题组与遗传发育研究所的高彩霞课题组，各自运用自己擅长的学科方法，克服了单碱基编辑工具脱靶检测的问题。杨辉课题组巧妙地运用了2细胞胚胎显微注射解决了这一问题。由于2细胞期胚胎中2个细胞的基因组背景几乎相同，所以保证了基因编辑工具刚进入其中一个分裂球时，这两个细胞的基因组几乎不会有本底水平的SNV差异。而高彩霞课题组则很好地运用了转染从同一克隆而来的水稻愈伤细胞形成植株来解决本底SNV的问题。

两个团队在不同系统中的研究结果十分吻合。ABE组内的SNV与对照组的SNV相近，这些SNV很可能是细胞增殖时自发产生的突变，可见ABE工具的特异性较高。与之截然相反的是，两组人员都在BE3实验组检测到了显著高于对照组的SNV数量，在杨辉组的实验结果中两者之间的差异达到了20倍。这些SNV类型基本都是C/G>T/A的突变，更重要的是BE3的脱靶似乎与Cas9的特异性关系不大。在杨辉的实验组中，只加入Cas9/sgRNA的实验组并不会引起全基因组范围内SNV的上升，这一点也驳斥了之前关于Cas9在小鼠体内造成严重大范围基因突变的报道。而在高老师的实验组中，不加入sgRNA，或者使用高保真型Cas9（HF1-BE3）BE3都能够引发全基因组范围的C/G>T/A脱靶现象。似乎BE3的脱靶只与rAPOBEC的活性有关。

由于之前检测BE3脱靶主要靠预测sgRNA脱靶位点或者体外Digenome-seq，并未发现BE3的严重脱靶现象。所以，高彩霞与杨辉实验组的研究结果能够让领域内的研究人员重新评估BE3的特异性，并及时推动更为精确的CBE系统的开发（目前还不知道，YEE-BE3与eA3A-BE3在体内的脱靶情况）以及相关脱靶检测方法的改进，这对于单碱基编辑工具乃至整个基因编辑领域都具有十分重要的意义。

参考文献
【1】M. J. Landrum et al., ClinVar: public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Res 44, D862-868 (2016).
【2】 S. Henikoff, L. Comai, Single-nucleotide mutations for plant functional genomics. Annu Rev Plant Biol 54, 375-401 (2003).
【3】 A. C. Komor et al., Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424 (2016).
【4】K. Nishida et al., Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science 353, (2016).
【5】N. M. Gaudelli et al., Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471 (2017).
【6】H. A. Rees, D. R. Liu, Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet 19, 770-788 (2018).

通讯作者简介
高彩霞，中国科学院遗传与发育生物学研究所研究员。1997 年毕业于中国农业大学，获农学博士学位。1997~2009 年在丹麦DLF-Trifolium公司科研部任课题组长，主要从事禾本科牧草的遗传转化和分子生物学研究。2009年加入中国科学院遗传与发育生物学研究所，2010年入选中国科学院“杰出技术人才”。2016年英国著名学术期刊《自然》评选为我国十位“科学之星”之一。2017年分别获得全国创新争先奖和谈家桢生命科学创新奖。同年入选国家百千万人才工程。
高彩霞课题组主要从事重要农作物基因组定向编辑技术方法的研究与应用，以及小麦、玉米等重要基因的功能解析及基因组编辑定向设计分子育种研究，并负责研究所生物技术平台的建设与管理。在基因组编辑技术领域作为通讯作者在Science、Nature Biotechnology、Nature Communications、Nature Plants、Nature Protocols、PLoS Biology、Molecular Plant、Plant Biotechnology Journal、Plant Journal 等国际学术刊物上发表论文及综述30 余篇。担任Science China Life Sciences、Genome Biology、The CRISPR Journal、Plant Biotechnology Journal 及Journal of Genetics and Genomics 编委。

论文原文链接：
science.sciencemag.org/content/early/2019/02/27/science.aaw7166

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