Nat. Commun.| 中科院上海植生所唐威华组解析植物-病原体互作的小分子机制

禾谷镰刀菌 (Fusarium graminearum) 是一种致病真菌，会引起禾谷类作物冠腐病、幼苗枯萎病、赤霉病和穗腐病等，同时禾谷镰刀菌还会在侵染的植物中留下各种毒素，威胁人畜健康【1-3】。目前只在小麦中鉴定出一种抗赤霉病 (Fusarium Head Blight, FHB) 基因PFT，还没有完全抗性的品种可供使用【4】。与许多其他真菌类似，禾谷镰刀菌存在很多次级代谢产物生物合成基因簇，如非核糖体肽合成酶 (non-ribosomal peptide synthetases, NRPS)、聚酮合酶(polyketide synthases, PKS) 以及萜烯环化酶 (terpene cyclases, TC) 等。禾谷镰刀菌基因组包含编码19个NRPS，15个PKS和7个TC的基因，以及67个其它的次级代谢产物生物合成基因簇。已经鉴定的基因簇和对应产物的有：单端孢霉烯、铁载体、玉米赤霉烯酮、镰刀菌素、aurofusarin 和 fusaristatin A等。据报道，目前只发现单端孢霉烯和细胞外铁载体是禾谷镰刀菌毒力所必需的【5-6】。鉴于禾谷镰刀菌庞大的基因簇数量，其具有产生更多有助于毒力及侵染的次级代谢物的潜力。


小麦赤霉病 图片来自网络

2019年2月26日，中科院上海植物生理生态研究所唐威华组与有机所刘文组合作在Nature Communications上在线发表了题为A linear nonribosomal octapeptide from Fusarium graminearum facilitates cell-to-cell invasion of wheat的研究论文。研究发现次级代谢物生物合成基因簇fg3_54的敲除严重影响禾谷镰刀菌通过细胞间渗透感染小麦的能力，并鉴定了此基因簇所对应的化合物：富含D-氨基酸的线性八肽fusaoctaxin A。通过一系列的实验验证表明fusaoctaxin A是禾谷镰刀菌对小麦细胞间作用所需的毒力因子。



研究人员前期发现，禾谷镰刀菌在小麦胚芽鞘感染期间，基因表达谱发生了阶段特异性的变化【7】。其中3号染色体上名为fg3_54的基因簇在体外生长期间几乎未检测到，但在接种小麦后约64小时 (h post inoculation, hpi) 明显上调。进一步的定量PCR显示，72 hpi后nrps5和nrps9的表达降低。Fg3_54含有两个多功能结构基因，即nrps5（FGSG_13878）和nrps9（FGSG_10990），其他六个基因是fgm5（FGSG_10995），fgm4（FGSG_10994），fgm3（FGSG_10993），fgm2（FGSG_10992），Fgm1（FGSG_10991），和fgm9（FGSG_10989）（图1a）。随后研究人员敲除整个fg3_54基因簇簇（FG-Δfg3_54）以及单个基因敲除株(如FG-Δfgm4, FG-Δfgm3, FG-Δfgm1, FG-Δfgm9, FG-Δnrps5)。结果表明FG-Δfg3_54突变株的毒力显著下降(如下图)。


fg3_54基因簇基因簇及其在禾谷镰刀菌侵染小麦中的作用

同时，研究人员使用mRFP和AmCyan标记禾谷镰刀菌野生型和突变株，来评估各fg3_54突变体对植物入侵过程的影响以及细胞水平的相关防御反应。结果表明，FG-WT-RFP和FG-WT-AmCyan菌丝通过细胞间扩散入侵~3 mm，并且在7 dpi时导致病变大于10 mm。相反，FG-Δfg3_54-RFP，FG-Δfgm4-RFP和FG-Δfgm5-AmCyan突变株的菌丝在靠近接种部位停滞，并且随着时间的推移未能渗透到邻近的细胞中。而且突变株菌丝的植物细胞壁显著增厚并显示出更强的自发荧光。这些细胞壁内陷，深度上变化为5μm，在宽度上变化为6μm（图中黄色箭头）。禾谷镰刀菌中敲除fg3_54基因簇或其关键修饰基因时，菌丝不能穿透植物细胞壁，这些结果暗示fg3_54产物在小麦中建立细胞间侵染模式的作用至关重要(如下图)。


fg3_54缺失株在小麦胚芽鞘细胞间侵袭能力下降及禾谷镰刀菌入侵小麦胚芽鞘示意图

唐威华组与有机所刘文组合作，解析了fg3_54对应的化合物及其生物合成途径。由于野生型禾谷镰刀菌与FG-Δfg3_54突变体在各种体外培养条件下未能产生有区别的寡肽产物，表明nrps9和nrps5可能受到严格的转录控制，并且特异性的作用于植物。在分析fg3_54序列后发现fgm4 (编码FGM4) 与来自 Fusarium semitectum 的Aps2和来自Cochliobolus carbonum 的ToxE具有低序列同源性，其与这些转录因子共享一个基本的DNA结合结构域。在胚芽鞘感染中FG-Δfgm4的毒力可以通过回补fgm4来补充。结合其他一系列实验结果都支持FGM4作为fg3_54基因簇特异性转录调控因子。于是研究人员构建了过表达株WT-OE::fgm4，在与FG-Δfg3_54的比较中发现WT-OE :: fgm4积累了一种新产物，随后研究人员鉴定此化合物为线性八肽fusaoctaxin A，并解析了其完整生物合成途径(如下图)。


鉴定fusaoctaxin A为fg3_54的主要产物并解析其生物合成途径

为了确定fusaoctaxin A是否导致fg3_54突变体的入侵缺陷，研究人员将fusaoctaxin A以不同浓度添加到FG-Δfg3_54-RFP突变体接种的小麦胚芽鞘上。结果表明fusoctaxin A以剂量依赖的方式恢复了FG-Δfg3_54-RFP侵入小麦的能力。此外，添加fusaoctaxin A（每穗20nm以上）也增加了由FG-Δfg3_54引起的症状性小穗数量，这进一步支持了fusaoctaxin A在小麦穗部感染中起作用。共聚焦显微镜显示，在3nmol fusaoctaxin A的情况下，FG-Δfg3_54-RFP菌丝在胚芽鞘内扩散并穿透小麦细胞壁，而邻近植物细胞壁的自发荧光也显著降低。表明fusaoctaxin A能够在细胞间侵袭时补充突变体FG-Δfg3_54的缺陷并抑制小麦感染中的宿主防御(如下图)。


禾谷镰刀菌感染的小麦穗的症状性小穗的数量和症状


Fusaoctaxin A恢复突变体中细胞间的侵染并增强野生型毒力

综上，研究人员发现了一种不常见的非核糖体线性八肽fusaoctaxin A，其作为禾谷镰刀菌的毒力因子在侵染小麦期间起重要作用。fusaoctaxin A具有属特异性，它通过细胞间渗透过程促进镰刀菌属的入侵，并在此过程中抑制宿主防御反应。本文结果是了解镰刀菌入侵期间小分子介导的植物-病原体相互作用的关键步骤，并提出了侵染模型(如下图)。


小麦感染期间fusaoctaxin A的作用示意图



参考文献

1. Bai, G. & Shaner, G. Management and resistance in wheat and barley to Fusarium head blight. Annu Rev. Phytopathol. 42, 135–161 (2004).

2. Desjardins, A. E., Hohn, T. M. & McCormick, S. P. Trichothecene biosynthesis in Fusarium species: chemistry, genetics, and significance. Microbiol. Rev. 57, 595–604 (1993).

3. Figueroa, M., Hammond-Kosack, K. E. & Solomon, P. S. A review of wheat diseases-a field perspective: a review of wheat diseases. Mol. Plant Pathol. 19, 1523–1536 (2018).

4. Buerstmayr, H., Ban, T. & Anderson, J. A. QTL mapping and marker-assisted selection for Fusarium head blight resistance in wheat: a review. Plant Breed. 128, 1–26 (2009).

5. Oide, S. et al. NPS6, encoding a nonribosomal peptide synthetase involved in siderophore-mediated iron metabolism, is a conserved virulence determinant of plant pathogenic ascomycetes. Plant Cell 18, 2836–2853 (2006).

6. Oide, S., Berthiller, F., Wiesenberger, G., Adam, G. & Turgeon, B. G. Individual and combined roles of malonichrome, ferricrocin, and TAFC siderophores in Fusarium graminearum pathogenic and sexual development. Front. Microbiol. 5, 759 (2015).

7. Zhang, X.-W. et al. In planta stage-specific fungal gene profiling elucidates the molecular strategies of Fusarium graminearum growing inside wheat coleoptiles. Plant Cell 24, 5159–5176 (2012).



论文原文链接：
doi.org/10.1038/s41467-019-08726-9

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