Nature Plants | 叶绿体高效遗传转化技术体系建立，为基因工程带来新的活力

质体是植物细胞内前质体分化而来，由双层膜包裹的一类细胞器。根据所含色素的不同，质体分为叶绿体、有色体和白色体。1988年，科学家在单细胞真核生物莱茵衣藻 (Chlamydomonas reinbardii) 中首次实现了叶绿体遗传转化。随后，科研人员在烟草 (Nicotiana tabacum) 中成功实现了叶绿体转化，证实质体可用于高等植物基因工程，叶绿体也随之成为研究质体基因工程的重点对象。与常见的核基因组转化相比，叶绿体转化具有外源基因表达高效、定点整合、无位置效应现象、遗传稳定，并且外源基因不会随花粉漂移等优点。目前，叶绿体转化已在拟南芥、马铃薯、番茄、油菜、水稻、胡萝卜以及杨树等多种植物中实现，然而转化效率低、缺乏有效的筛选标记以及再生植株不育等问题阻碍了叶绿体转化技术的大规模应用。

2019年2月18日，Nature Plants 在线发表了德国马普分子植物生理研究所Ralph Bock教授实验室题为High-efficiency generation of fertile transplastomic Arabidopsis plants的研究论文，报道了一种高效的质体遗传转化技术体系。该技术以拟南芥根系愈伤为材料，利用基因枪方法实现了拟南芥叶绿体的高效转化。利用CRISPR/Cas9技术敲除拟南芥自身的有关抗性基因，进一步提高了转化效率，并有效解决了叶绿体遗传转化再生植株不育的问题。



叶绿体转化利用携带外源基因载体的侧翼序列与叶绿体DNA同源区段发生同源重组，实现外源基因向叶绿体基因组的定点整合。外源基因向叶绿体基因组的定点整合有多种方法可以实现，目前所进行的质体基因工程多以基因枪法为主。在该研究中，研究人员对Weigel和Glazebrook的拟南芥根转化体系进行了优化和升级，利用基因枪对拟南芥根愈伤进行叶绿体转化并利用壮观霉素（ spectinomycin）进行筛选。同时，利用基因枪对拟南芥根愈伤进行了核基因组的转化作为对照进一步优化叶绿体转化和再生条件。


Workflow of the transformation experiments.

接下来，研究人员根据番茄上已发表的结果，构建了用于转化拟南芥叶绿体基因组的载体。打了超过1350次基因枪，从7种载体中选择出 pCH8用于后续实验。pCH8带有壮观霉素抗性基因aadA，可用于再生植株的抗性选择。


Transformation vectors and selection of transplastomic plants.

由于一些植物本身具有壮观霉素的天然抗性, 导致aadA选择标记对部分植物的筛选效率低, 限制了该选择标记的应用。有研究表明，由ACC2 基因编码的乙酰辅酶A羧化酶（CoA carboxylase，ACCase）活性降低可以增加拟南芥对壮观霉素的敏感性（抗性降低）【7】。因此，研究人员利用CRISPR/Cas9系统敲除了ACC2基因后，壮观霉素可以完全抑制acc2突变体的生长。研究人员继续以acc2突变体为材料，利用本研究中的转化体系对其进行叶绿体转化，获得了更高的叶绿体转化效率，以及更高的可育植株比例。

最后，作者总结该研究建立拟南芥叶绿体转化方法的关键是：利用基于根的筛选和再生体系，不受体细胞内源多倍化的影响，促进了可育植物的有效再生；核基因ACC2的敲除促进了对壮观霉素抗性植株的选择。该研究建立的方法虽然在野生型中也能获得可育的转基因拟南芥，利用CRISPR/Cas9产生的acc2突变体大大提高了叶绿体转化的选择效率。

Ralph Bock教授在植物细胞器生物学与生物技术研究领域享有重要的国际声誉。曾任德国马普分子植物生理所所长，2010年当选为德国科学院院士。相关研究成果发表在Science, Nature等杂志，并多次受邀在Annual Review of Plant Science, Current Opinion in Biotechnology等刊物上发表年度综述，担任Plant Cell, Plant Biotechnology Journal, Eukaryotic Cell, Current Genetics等杂志主编或编委，同时还是EFSA, CNRS , IPK, DFG等多家学术与政府机构的科学顾问。

参考文献：
1. Boynton, J. E. et al. Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science 240, 1534–1538 (1988).
2. Svab, Z., Hajdukiewicz, P. & Maliga, P. Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl Acad. Sci. USA 87, 8526–8530 (1990).
3. Maliga, P. Plastid transformation in higher plants. Annu. Rev. Plant. Biol. 55, 289–313 (2004).
4. Fuentes, P., Armarego-Marriott, T. & Bock, R. Plastid transformation and its application in metabolic engineering. Curr. Opin. Biotechnol. 49, 10–15 (2018).
5. Weigel, D. & Glazebrook, J. Root transformation of Arabidopsis. Cold Spring Harb. Protoc. https://doi.org/10.1101/pdb.prot4671 (2006).
6. Ruf, S., Hermann, M., Berger, I. J., Carrer, H. & Bock, R. Stable genetic transformation of tomato plastids and expression of a foreign protein in fruit. Nat. Biotechnol. 19, 870–875 (2001).
7. Parker, N., Wang, Y. & Meinke, D. Analysis of Arabidopsis accessions hypersensitive to a loss of chloroplast translation. Plant Physiol. 172, 1862–1875 (2016).

论文原文链接：
doi.org/10.1038/s41477-019-0359-2

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