《自然医学》双重磅：CRISPR曝重大漏洞！被成功编辑的细胞或缺失抑癌基因p53
这两项研究分别来自瑞典卡洛林斯卡研究所和剑桥诺华生物医学研究院，两个团队分别独立发现，CRISPR/Cas9基因编辑过程中造成的DNA双链断裂，实际上可以激活p53蛋白通路。该蛋白在基因修复过程中有关键作用，一定程度上导致了基因编辑的失败。这也意味着，基因编辑成功的细胞，往往具有p53缺陷——这也是癌细胞中最常见的基因突变！
换句话说，基因编辑成功的细胞很可能是潜在的癌细胞，利用CRISPR/Cas9进行临床治疗可能会无意中增加患癌症的风险！
CRISPR/Cas9可以说是发展得仿佛坐了火箭，这项技术首次走入人们眼帘还是在2012年，但是第一项临床试验去年就已经在中国进行了。技术走得太快，就必然存在一些尚未被发现的缺陷。
CRISPR/Cas9技术在应用过程中有个奇怪的现象，它在转化细胞（例如癌细胞）上编辑效率很高，副作用也很小；但是在治疗疾病方面具有极高潜能的人多能干细胞（hPSC）上，效率却咋也提不起来。与其他细胞类型相比，hPSC的基因修饰效率只有五到二十分之一。
面对基因修饰，hPSC简直顽强到底，“宁死不从”。
为了找出这其中的关键，剑桥诺华生物医学研究院研究者们开发了一种干细胞系，这种细胞在特定条件下表达Cas9蛋白，只需慢病毒转染gRNA就能实现插入特定基因序列。
这种方法的编辑效率很高，超过80%的细胞都转入了目标序列，但是更惨烈的是，绝大多数细胞都没能熬过这个过程，只有极少数的hPSC存活了下来。
CRISPR/Cas9过后，满地残留着细胞碎片，这个CRISPR/Cas9有毒啊……
研究者想到，是不是转入的gRNA种类太多，一次编辑好几个位点细胞受不了呢？以前也有研究显示编辑多个位点是对细胞损伤很大的。于是这次他们固定选择了一种不耽误细胞生存的基因，重复了上述实验，然而结果也是类似的。
对照组的细胞不涉及DNA链的断裂，就能好好生存好好扩增，而接受了基因插入的细胞真是惨烈极了，只有少部分尚能活蹦乱跳，大部分都没能熬过改造。
可见单个位点的DNA双链断裂，就足以对hPSC产生致死的毒性了！
为了探究这个过程中的关键分子通路，研究者们对表达变化较大的基因进行了筛选，最终发现最关键的人物竟然是我们都很熟悉的老朋友p53！进一步摸索，下游的通路则是与p21有关。确实，p53本身也在DNA损伤修复过程中起到了很大的作用，对能修复的损伤就修复，修复不了就让细胞自杀。
研究者尝试在细胞系中敲除p53基因，不出所料，p53缺陷的hPSC马上就对基因编辑表示驯服，不再拼死抵抗，生存率大大增加了。另一方面，在两个不同的干细胞系中，敲除p53使基因编辑的效率分别增加了19倍和16倍！
在另一项研究中，卡洛林斯卡研究所研究者在视网膜色素上皮（RPE）细胞中进行了类似的研究，同样发现CRISPR/Cas9基因编辑导致的DNA双链断裂会激活p53-p21通路，诱导细胞周期的停滞，导致基因编辑的失败。
除此之外，研究者还发现，在DNA双链被成功切断之后，Cas9蛋白还会在切断位点停留6个小时之久，这很可能耽误了正常的DNA损伤修复，加剧了DNA双链断裂带来的影响。
作者之一的Emma Happaniemi在采访中说，“挑选成功完成受损基因修复的细胞，我们很可能无意中挑选到p53缺陷的细胞。”“如果移植到患者体内，比如说在治疗遗传疾病的场景下，这些细胞很可能会引发癌症，导致人们对CRISPR基因治疗安全性的担忧。”
这两篇论文一出，市场为之震动。目前已经走在临床前沿的CRISPR Therapeutics股价暴跌13%——这已经是上周被FDA叫停临床试验之后短期内第二次下跌了——其他基因编辑公司也受到了不小的影响，Editas Therapeutics、Intellia Therapeutics股价均有10%左右的下跌。
CRISPR Therapeutics首席执行官Sam Kulkarni表示，该研究结果可信，虽然研究内容实际并不能覆盖所有的CRISPR使用情景。另一位因利益关系不愿透露姓名的科学家则表示十分担心，很多CRISPR导致的致命缺陷可能“已被错过”。
看起来CRISPR/Cas9和p53之间的矛盾是不可调和的。要么p53不在，细胞有癌变风险；要么p53在，基因编辑失败和细胞自毁二选一。
但是这并不意味着CRISPR技术走进了死胡同。
卡洛林斯卡研究所的生化学家Bernhard Schmierer表示，这些都是十分早期的研究，只是“初步成果”，“目前还不清楚这些发现是否可以影响到临床实际使用的细胞。”此前在实验室中进行的研究，从未发现CRISPR导致的癌症，也一定程度上说明了问题。
而且研究关注点在于CRISPR/Cas9技术，在此之外，还有Cpf1等诸多颇具希望的Cas酶，这些酶是否会出现同样的p53困境还未可知。研究者也认为，如果只是剪除致病基因，而不涉及新基因的插入的话，p53是不会被“调动"的。
再说了，这个问题并不是完全没有办法解决。在现有的技术条件下，我们可以对编辑前后的细胞进行测序，监控p53功能，规避风险。
研究者们正在努力寻找p53通路的详细作用过程，如果可以在基因编辑过程中让p53暂时歇一歇，那岂不是美哉？而且在某些情况下，我们还有不需切断DNA的单碱基编辑技术，还是大有可为滴。
来自肯特大学的遗传学家Darren Griffin教授有句话说得很好，“几乎任何能够带来益处的治疗方法，都有能力造成伤害，这些发现应当被放在更大的背景中去思考。”
技术前行总会遇到瓶颈，而每一次挫折都将使让我们更加强大。
本文来源于：转化医学网
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