氮高效转基因水稻OsNRT2.3b对土壤氨氧化细菌群落多样性的影响

来源：《农业环境科学学报》2017 年 06 期
作者：魏琳琳 杨殿林 侯萌瑶 倪土 李刚 修伟明 王慧 赵建宁
单位：农业部环境保护科研监测所，东北农业大学资源与环境学院

文章以氮高效转基因水稻OsNRT 2.3b 两个不同株系N-04 和N-08 为研究对象，以非转基因亲本日本晴（Nipp）为对照，在田间小区试验条件下，设施氮和不施氮两种处理，采用变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术，分析了氮高效转基因水稻在生长期对土壤氨氧化细菌群落多样性的影响。

研究发现，水稻土壤氨氧化细菌丰富度指数在各生长期内品种间均不存在显著差异。两种处理条件下N-04 的土壤氨氧化细菌香农-威纳指数仅在拔节期与Nipp 有显著差异，其余生育期均无显著差异；在施氮条件下N-08 的土壤氨氧化细菌香农-威纳指数在拔节期和抽穗扬花期与Nipp 存在显著差异，不施氮条件下仅拔节期出现显著差异。两种处理条件下，N-04 的土壤氨氧化细菌均匀度指数与Nipp 相比整个生长期均无显著差异，而N-08 在拔节期显著低于Nipp。测序结果表明，施氮和不施氮处理下氮高效转基因水稻（N-08 和N-04）与Nipp 相比土壤中拥有更多的亚硝化螺旋菌属（Nitrosospira）和亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）。

研究表明，氮高效转基因水稻在个别生育期对香农-威纳指数和均匀度指数有显著差异，且其更有利于促进土壤铵态氮向硝态氮的转化。

前言

从1996 年到2015 年，全球转基因作物累计种植面积达到空前的20 亿hm2，转基因作物已经成为现代农业史上推广最为迅速的农作物，但转基因作物在给人们带来巨大经济效益的同时，其所带来的生态安全性问题也日益引起公众的广泛关注，尤其是对土壤微生物群落多样性的影响。有研究表明，转基因棉花的种植能使土壤细菌和真菌的数量明显增加，使其群落组成发生变化，也有文献报道转基因作物的种植未对土壤微生物群落结构产生显著影响。然而，要更为深入评价转基因植物对土壤微生物的影响，在研究分析整体微生物群落的过程中，还应研究转基因植物对土壤指示性微生物的影响。

氨氧化细菌作为微生物生态学研究的指示性微生物，同时也是执行硝化作用第一步（将氨氧化为亚硝酸盐即硝化速率限制性步骤）的关键微生物，在土壤氮素循环中占有重要地位，但其群落组成容易受气候条件、土壤利用方式和植被类型等的影响，因此受到相关领域科学家的广泛关注。

氮高效转基因水稻OsNRT 2.3b 是利用转基因技术将水稻高亲和硝酸盐转运蛋白OsNRT 2.3b 基因导入受体而获得的超表达材料。Fan 等和唐仲研究发现，与常规稻相比，OsNRT 2.3b 超表达株系中积累的氮素总量提高了21%，铵态氮吸收速率提高了12%，氮素利用效率提高了40%，单株产量提高了30%。由于土壤氮循环长期处于一个动态平衡的状态，氮高效转基因水稻的种植势必会从土壤中吸收更多的氮素，改变土壤氮素动态特征，进而可能影响土壤氨氧化细菌群落结构。

本研究采用PCR-DGGE 技术，以氮高效转基因水稻OsNRT2.3b 的两个不同株系N-04 和N-08 为对象，研究其土壤氨氧化细菌16S rDNA 基因群落结构及多样性组成，为科学评价氮高效转基因水稻对土壤微生物的影响提供理论依据。

1 材料与方法

1.1试验地概况与试验设计

试验在农业部环境保护科研监测所网室内进行，种植小区四周及底部为混凝土结构，内部长、宽、高均为1 m，小区内土壤为天津市津南区未种植过作物的潮土，全磷含量1.19 g·kg-1，全氮含量0.96 g·kg-1，有机质含量24.55 g·kg-1，pH 8.21。

试验采用完全随机区组设计，设施氮和不施氮两种处理，5 次重复。氮源（20 g·m-2）为尿素[CO（NH2）2]，其中50%用作基肥，50%作追肥，追肥在水稻分蘖后期施用。分别以磷酸二氢钾（P2O5：15 g·m-2）和硫酸钾（K2O：18 g·m-2）作为磷肥和钾肥，全部用作基肥。

1.2供试材料

试验所用水稻为氮高效转基因水稻OsNRT 2.3b的两个不同株系N-04 和N-08 及非转基因亲本日本晴Nipp，均由南京农业大学资源与环境科学学院植物营养分子生物学实验室提供。水稻种子于2015 年5 月8 日播种于培养盘中，每穴5 粒，于6 月25 日移苗，挑选长势一致的水稻苗，每个小区内移栽水稻20 株。

1.3土壤样品采集

分别于水稻分蘖期（7 月27 日）、拔节期（9 月8 日）、抽穗扬花期（10 月10 日）和成熟期（11 月12 日）采集土样。采集土样时，去除表面杂草和枯枝落叶，用直径3.5 cm 的土钻在距水稻主茎2 cm 处取20 cm 深的土样，每小区3 个取样点。将各个小区的样品分别混合，置于-20 ℃冰箱，用于土壤氨氧化细菌群落多样性分析。

1.4测定方法

1.4.1土壤微生物总DNA 提取

本研究采用Mo Bio 公司的Powerlyzer powersoil DNA isolation kit（Mo Bio laboratories，Solana Beach，CA，USA）试剂盒，取0.5 g 鲜土置于Glass Bead Tube 中，按操作说明逐步进行提取，将提取到土壤的DNA 用1.5%的琼脂糖凝胶检测样品质量，并于-20 ℃保存。

1.4.2PCR 扩增

采用巢式PCR（Nested PCR）方法扩增氨氧化细菌16S rDNA 基因序列，引物及反应条件见表1。第一轮PCR 反应产物大小为465 bp，PCR 反应体系为50 μL（两种引物各0.5 μL，Premix Ex Taq 25 μL，稀释2 倍的土壤DNA 模板5 μL，用灭菌水补足至50 μL）；第二轮PCR 反应产物大小为250 bp，PCR 反应体系为50 μL（两种引物各0.5 μL，Premix Ex Taq 25 μL，第一轮PCR 产物5 μL，用灭菌水补足至50 μL）。